芪龍風濕丸聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎的療效及對外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平的影響

劉 銳，劉秋紅，李晶晶，趙 琳，徐薇薇

(蘇州市中醫(yī)醫(yī)院風濕科，江蘇 蘇州 215009)

據(jù)報道，類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病率為0.32%～0.36%[1]。其主要癥狀有晨僵、雙手及腕等小關節(jié)對稱性疼痛、腫脹、功能障礙、關節(jié)端骨質疏松及多關節(jié)受累等，患者晚期可出現(xiàn)畸形、強直及功能缺損等[2]。RA的發(fā)病機制較為復雜，病情呈進展趨勢且不可逆轉，目前臨床治療以減輕RA癥狀和保護關節(jié)功能為主，主要治療藥物有非甾體抗炎藥、免疫抑制劑及糖皮質激素等。然而長期或大劑量使用這些藥物會產(chǎn)生較多的不良反應，如胃腸反應、肝腎功能損傷、血小板下降等[3-4]。RA在中醫(yī)學中被歸為“痹病”“尪痹”等疾病范疇，患者的病程常遷延不愈，形成頑痹[5]。芪龍風濕丸是由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院高忠恩主任總結歷代中醫(yī)特別是吳中醫(yī)學診治痹證的經(jīng)驗，并結合自身長期臨床實踐創(chuàng)制的具有吳中醫(yī)藥清靈平和的特色方藥，原方經(jīng)多年臨床使用，取得良好療效[6-7]。而微RNA(microRNA，miRNA)是參與高等生物基因表達調控的重要分子，其參與RA的發(fā)病過程。本研究旨在探討芪龍風濕丸聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA的療效及對外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平的影響，為該方藥的臨床使用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2018年10月蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院收治的78例RA患者為研究對象。納入標準：①符合RA診斷標準，且經(jīng)辨證為肝腎陰虛證；②年齡18～70歲；③入組前1個月內未給予RA治療；④受試者及其家屬自愿加入本研究，且簽署知情同意書。排除標準：①妊娠期和準備妊娠的婦女，或哺乳期婦女；②神志不清者；③合并其他自身免疫性疾病；④過敏體質或有食物、藥物過敏史者；⑤伴精神病或心、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病；⑥關節(jié)疾病或關節(jié)畸形者。上述患者按照治療方法不同分為對照組和觀察組，每組39例。兩組患者的性別、年齡、病程、關節(jié)功能分級[8]、X線分期[8]比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

表1 兩組RA患者的基線資料比較

RA：類風濕關節(jié)炎；對照組：在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片；觀察組：在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸；a為χ2值，余為t值

1.2診斷標準 RA診斷標準參照《RA診斷及治療指南》[8]：①晨僵持續(xù)時間≥1 h，且病程≥6 周；②關節(jié)疼痛數(shù)≥3 個，且病程≥6 周；③關節(jié)腫脹呈對稱性；④腕、掌指及近側指間關節(jié)腫脹，且病程≥6 周；⑤類風濕因子(rheumatoid factor，RF)為陽性；⑥伴有類風濕結節(jié)；⑦手部放射學呈現(xiàn)典型的RA改變且伴糜爛和(或)骨質脫鈣。同時符合上述 7項中的4項則可診斷為RA。

1.3治療方法 常規(guī)治療：根據(jù)RA診斷及治療指南[8]給予非藥物治療；宣傳規(guī)范治療理念，給予適當休息、體療及關節(jié)功能訓練等。其中，對照組在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片(上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，批號：B14202516139)，每次10 mg，每周1次。觀察組在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸，組方：黃芪20 g、地龍12 g、知母15 g、青風藤12 g、川石斛15 g、桑寄生15 g、雞血藤12 g、桂枝 10 g、桑枝12 g、狗脊12 g、續(xù)斷12 g、生地黃15 g；丸劑制作過程中雞血藤、青風藤、桑枝、川石斛加水煎2次，每次1.5 h，合并過濾濃縮與余藥共研細粉，過80目篩。用藥粉泛丸，烘干，質檢，分裝。兩組均治療12周。

1.4觀察指標 治療前后觀察兩組患者的以下指標：①兩組患者的主要癥狀、體征評分，評價指標有類風濕關節(jié)炎活動度評分-28(disease activity score for rheumatoid arthritis-28，DAS-28)、數(shù)字評分法(numerical rating scale，NRS)、雙手平均握力、晨僵時間。其中DAS-28[9]，即28個關節(jié)的腫脹和壓痛評分，根據(jù)DAS-28病情活動分4級：DAS-28≤2.6分為病情緩解，2.6分5.1分為重度活動。疼痛程度采用NPS評分[10]，指導患者選擇最接近自身疼痛程度的數(shù)字，0分為無痛，1～3分為輕度疼痛，4～6分為中度疼痛，7～10分為重度疼痛。記錄患者的雙手平均握力和晨僵時間。②兩組患者的紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、RF水平。ESR采用魏氏法檢測，RF采用膠乳凝集試驗。③兩組患者的外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平。采集患者晨起空腹外周血，肝素鈉抗凝6 h內采取實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平。

1.5療效判斷標準 療效判斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[11]：①臨床控制，ESR基本正常，療效指數(shù)(DAS-28、NPS評分、雙手平均握力、晨僵時間)≥80%；②顯效，ESR明顯改善，50%≤療效指數(shù)<80%；③好轉，ESR有改善，30%≤療效指數(shù)<50%；④無效，ESR無改善，療效指數(shù)<30%。總有效率=(臨床控制例數(shù)+顯效例數(shù)+好轉例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2 結 果

2.1兩組患者的臨床療效比較 觀察組總有效率高于對照組[94.87%(37/39)比74.36%(29/39)](χ2=6.303,P=0.012)，觀察組的臨床療效優(yōu)于對照組(Z=-2.860,P=0.04)。見表2。

表2 兩組RA患者的臨床療效比較 (例)

RA：類風濕關節(jié)炎；對照組：在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片；觀察組：在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸

2.2兩組患者的主要癥狀、體征比較 治療12周后，兩組患者的DAS-28、NRS評分明顯降低，雙手平均握力顯著增加，晨僵時間縮短(P<0.05)；與對照組相比，觀察組的DAS-28、NRS評分下降，雙手平均握力增加，晨僵時間縮短(P<0.05)。兩組DAS-28、NRS評分、雙手平均握力的組間、時點間、組間和時點間交互作用比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組晨僵時間的組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，時點間、組間和時點間交互作用比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組RA患者治療前后的主要癥狀、體征比較

RA：類風濕關節(jié)炎；DAS-28：類風濕關節(jié)炎活動度評分-28；NRS：數(shù)字評分法；對照組：在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片；觀察組：在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸

2.3兩組患者的ESR和RF水平比較 治療12周后，兩組患者的ESR和RF水平均明顯下降(P<0.05)；與對照組相比，觀察組的ESR、RF水平下降更明顯(P<0.05)。兩組ESR和RF水平的組間、時點間、組間和時點間交互作用比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。

組別例數(shù)ESR(mm/1 h)治療前治療后RF(kU/L)治療前治療后對照組3957.9±7.426.1±4.185.3±10.552.4±7.4觀察組3958.1±6.917.9±2.785.2±10.833.6±5.4 組間F=11.556 P=0.001F=55.452 P<0.001 時點間F=1 376.182 P<0.001F=735.103 P<0.001 組間·時點間F=36.744 P<0.001F=22.075 P<0.001

RA：類風濕關節(jié)炎；ESR：紅細胞沉降率；RF：類風濕因子；對照組：在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片；觀察組：在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸

2.4兩組患者的外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平比較 治療12周后，兩組患者的外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平均顯著降低(P<0.05)；與對照組相比，觀察組的外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平下降更明顯(P<0.05)。兩組miR-146a的組間、時點間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，組間和時點間交互作用比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組miR-155、miR-124a的組間、時點間、組間和時點間交互作用比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表 5。

3 討 論

歷代醫(yī)家對痹證論述非常詳盡。《濟生方》指出：“皆因體虛，腠理空疏，受風寒濕氣而成痹也”；《類證治裁》曰：“諸痹……良由營氣先虛，腠理不密，風寒濕乘虛內襲、正氣為邪所阻……久而成痹”。中醫(yī)學認為，RA是以元氣不足(包括稟賦不足、肝腎虧損、氣血虧虛)為致病的基礎，復因起居失常、或勞累過度、或產(chǎn)后體虛等因素，引起衛(wèi)陽不固，腠理疏松，寒濕邪乘虛而入，搏結于筋骨、經(jīng)絡、關節(jié)、肌肉、痹阻不通，不通則痛，乃成痹證[12-13]。據(jù)統(tǒng)計，肝腎陰虛型RA的發(fā)生率約為26.8%[14]。肝主筋，腎主骨生髓，關節(jié)為筋骨之會，肝腎陰虛則筋骨失去濡養(yǎng)，易造成筋骨枯萎、骨質破壞等[15]。《素問·經(jīng)脈別論》云：“肝之氣血虧虛，筋膜失養(yǎng)，則筋力不健，運動不利。”對RA肝腎陰虛證的治療當以補益肝腎、蠲痹通絡為主。

芪龍風濕丸中的桑寄生、狗脊、續(xù)斷以補益肝腎而強壯筋骨，且桑寄生、狗脊兼可祛風濕，續(xù)斷能續(xù)折傷；知母苦寒而潤，上能清潤肺金，下能滋清腎水；雞血藤補血、活血、通絡；桂枝、桑枝、青風藤祛痹通絡，且桂枝兼有溫經(jīng)散寒、通利血脈之功效；生地黃清熱生津，黃芪健脾益氣，石斛益胃生津、滋陰清熱，三藥合用大補氣陰；痹證如久病不愈或失治延治，病邪易滯于血脈，故吳門醫(yī)派代表人物葉天士提出著名的“久病入絡”學說，認為“血脈痹阻絡脈不通，宜通之” ，并提出虛人久痹宜養(yǎng)肝腎氣血的治痹方法；葉天士曰：“邪留經(jīng)絡，須以搜剔動藥”。但正虛邪實不可急攻，故采用“宿邪益緩攻”的治療方法，方中選用地龍，可使“血無凝著，氣可宣通”；全方以甘潤辛通，發(fā)揮補益肝腎、蠲痹通絡之功效。本研究結果顯示，觀察組總有效率高于對照組；治療12周后，兩組患者的DAS-28、NPS評分及ESR、RF水平均明顯降低，雙手平均握力顯著增加，晨僵時間明顯縮短，且觀察組上述指標改善均優(yōu)于對照組，提示芪龍風濕丸聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA療效顯著。

表5 兩組RA患者治療前后外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平比較

RA：類風濕關節(jié)炎；miRNA：微RNA；對照組：在常規(guī)治療的基礎上給予甲氨蝶呤片；觀察組：在對照組的基礎上給予芪龍風濕丸

多種免疫細胞和細胞因子參與RA的發(fā)病機制，而miRNA參與T、B淋巴細胞的分化及固有免疫應答和適應性免疫應答，是RA發(fā)生發(fā)展的重要調節(jié)因素[16-17]。miR-146a在RA患者滑膜組織的表達水平顯著高于骨關節(jié)炎患者和健康人；實時定量聚合酶鏈反應檢測發(fā)現(xiàn)，miR-146a在RA患者外周血單個核細胞和血漿中的表達水平顯著升高[18]。RA患者的miR-146a表達水平明顯升高，其可能通過上調腫瘤壞死因子-α，參與RA的病情活動性及關節(jié)破壞[19]。miR-155主要由T細胞、B細胞、單核細胞等釋放，其參與人體免疫系統(tǒng)的調節(jié)，通過減少基質金屬蛋白酶3的分泌，從而抑制滑膜成纖維細胞的增殖、侵襲；同時，miR-155也能減輕炎癥反應狀態(tài)，間接改善RA患者的血瘀狀態(tài)[20-21]。miR-124a是一個與增生緊密相關的miRNA，其在RA患者滑膜細胞的表達量是骨性關節(jié)炎患者的1/6，將miR-124a的前體轉染至RA患者滑膜細胞后可抑制其增殖，并阻滯細胞周期在G1期[22]。miR-124a 也可通過抑制RA致病過程中的炎癥介質(白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)的釋放，以緩解RA病情發(fā)展[23]。本研究中治療12周后，與對照組相比，觀察組外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平顯著降低，提示調節(jié)外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平可能是芪龍風濕丸聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA的有效作用途徑之一。

綜上可知，芪龍風濕丸聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA療效確切，其治療效果可能與調節(jié)外周血miR-146a、miR-155、miR-124a水平有關。由于芪龍風濕丸是中藥復方制劑，而RA的病因病機十分復雜，所以關于芪龍風濕丸的作用靶點和作用機制仍需進一步探討。