喉鱗狀細胞癌患者血清中miRNAs表達譜分析

徐志遠,秦 永

(1.莒南縣人民醫院 青島大學醫療集團莒南醫院耳鼻喉科，山東 莒南 276600；2.北京大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科,北京 100034)

盡管目前臨床手術以及放化療技術取得了巨大的進步，但全球每年仍有超過8萬喉癌患者死亡[1]。喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其中以喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)最常見，約占90%，常見于男性[2]。喉癌診斷時往往已是晚期，患者的5年生存率低于50%[3]。喉癌的早期診斷標志物對其早期診斷和早期治療十分重要。微RNA(microRNA，miRNA)指長度18～25個核苷酸的內源性微小非編碼單鏈RNA，miRNA通過影響靶向信使RNA的3′非翻譯區結合蛋白參與調節轉錄后基因表達，人體30%以上信使RNA受到miRNA的控制調節[4]。大量數據表明，miRNA在人類多種癌癥中高表達，并在人類腫瘤的發生、發展和轉移中起關鍵作用[5-9]。近年來，miRNA在LSCC靶向治療、診斷及轉移、預后等方面的研究成為喉癌的研究熱點。本研究通過檢測術前LSCC患者血清miRNA表達水平，并與健康者對比，以探究血清miRNA作為診斷LSCC的潛在生物標志物的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2019年1月莒南縣人民醫院耳鼻喉科收治的82例LSCC患者作為研究組，同期50名健康者作為對照組。納入標準：①經病理活組織檢查確診為LSCC；②年齡18～80歲；③接受手術治療；④初次診斷為LSCC的患者。排除標準：①術前接受放化療的患者；②伴有傳染性疾病(如結核)、慢性疾病(如糖尿病)以及口腔疾病(如口腔潰瘍)的患者；③患有精神疾病的患者；④溝通有障礙、非自愿參與本研究的患者。本研究獲得莒南縣人民醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2方法 收集所有研究對象的基本資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史。收集LSCC患者的臨床資料，包括腫瘤臨床分期(國際抗癌聯盟喉癌TNM分期)和腫瘤分化程度。于研究組治療前采集所有研究對象同期空腹靜脈血4 mL，所有血液標本經離心后，取上層血清，置于-80 ℃條件下儲存備用。

1.2.1LSCC相關miRNA標志物的篩選 選取研究組和對照組各8例，采用miRNA提取試劑盒(德國Qiagen公司，批號：217184)抽提血液miRNA，隨后采用帶有莖環的特異引物反轉錄試劑盒進行反轉錄(德國Qiagen公司，批號：218161)，最后進行miRNA表達譜芯片檢測。按照說明書進行操作，通過分析比較16例樣本的血清miRNA表達情況來篩選LSCC血清miRNA標志物。

1.2.2血清miRNA標志物的表達 選擇研究組和對照組平均Ct值差異有統計學意義的miRNA作為診斷LSCC的miRNA標志物。提取血清miRNA進行逆轉錄，使用聚合酶鏈反應定量檢測試劑盒(德國Qiagen公司，批號：218073)檢測相應血清miRNA的表達量。采用RNA U6作為內參，每個miRNA采用 3個復孔取平均值，反應體系按照說明書配置進行聚合酶鏈反應擴增，具體過程為：在95 ℃條件下預變性1 min→在95 ℃條件下變性15 s→在60 ℃條件下退火30 s→在72 ℃條件下延伸1 min，循環進行40次，根據與內參表達量的差值計算每種miRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、飲酒史和吸煙史比例比較差異無統計學意義(P>0.5)，見表1。研究組T1～2期24例、T3～4期58例，N0期63例、非N0期19例，所有患者均無遠處轉移；臨床分期：1～2期21例，3～4期61例；分化程度：高分化8例，中分化68例，低分化6例。

表1 兩組受試者一般資料比較 [例(%)]

對照組：健康人群；研究組：喉鱗狀細胞癌

2.2兩組血清miRNA標志物表達的差異 研究組血清miR-31、miR-141、miR-149a、miR-182、miR-485-3p、miR-122、miR-33、miR-205的相對表達量較對照組高(P<0.01)，而miR-133a、miR-223和miR-145的相對表達量較對照組低(P<0.01)，見表2。

2.3血清miRNA標志物的診斷價值 依次分析篩選出的具有統計學意義的血清miRNAs對LSCC的辨別能力，其中miR-31的AUC值為0.99(95%CI0.99～1.00)(P<0.05)；miR-33的AUC值為0.98(95%CI0.95～1.00)(P<0.05)；miR-205的AUC值為0.97(95%CI0.95～1.00)(P<0.05)，具有較高的LSCC診斷價值，見表3和圖1A、B、C。

組別例數miR-31miR-141miR-149amiR-182miR-485-3pmiR-122對照組501.46±0.331.52±0.292.42±0.561.72±0.412.72±0.612.94±0.58研究組826.94±0.365.82±0.333.38±0.614.94±0.487.88±0.659.94±0.61t值87.51275.9549.04339.45145.27265.144P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001組別例數miR-33miR-205miR-133amiR-223miR-145對照組502.76±0.621.44±0.224.08±0.432.05±0.232.94±0.21研究組8220.62±0.785.96±0.251.16±0.350.77±0.190.62±0.17t值137.510105.34242.58834.63157.234P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

對照組：健康人群；研究組：喉鱗狀細胞癌患者

表3 血清miRNA標志物診斷價值

miRNA：微RNA；AUC：曲線下面積

2.4血清miRNA標志物與臨床資料的相關性分析 以miR-31、miR-33、miR-205作為因變量，LSCC患者的各項臨床資料[性別(以女性作為參照)、年齡(以≤65歲作為參照)、吸煙(以不吸煙作為參照)、飲酒(以不飲酒作為參照)、T分期(以T1～2作為參照)、臨床分期(以Ⅰ～Ⅱ期作為參照)、腫瘤分化程度(以低分化作為參照)]作為自變量的相關分析顯示，血清miR-31、miR-33、miR-205水平與患者基本臨床資料均無相關性(P>0.05)，見表4。

miRNA：微RNA；LSCC：喉鱗狀細胞癌

表4 血清miRNA標志物與臨床資料的相關性分析

3 討 論

LSCC是常見的頭頸部惡性腫瘤，臨床診斷時常已是晚期，尋找快速、無創、有效的早期LSCC生物標志物對LSCC的早期診斷至關重要。多項研究表明，miRNA在腫瘤組織和正常組織的表達水平比較差異有統計學意義，故可將miRNA作為診斷腫瘤的有效生物標志物，但獲取腫瘤組織標本的過程往往是有創操作[10-14]。空腹靜脈血是臨床檢查常見的生物學標本，具有創傷小、易于操作的特點。本研究通過比較LSCC患者以及健康對照組血清標本miRNA的表達情況，旨在篩選能有效辨別LSCC的潛在生物標志物。

miR-23在LSCC患者腫瘤組織的表達水平顯著升高，且與LSCC患者的臨床分期及5年生存率存在顯著相關性[15]。研究發現，腫瘤組織miRNA分子可作為喉癌診斷及其預后判斷的有效生物學指標，其中部分miRNA(如miR-221和miR-378)可作為評估喉癌患者療效及預后的有效生物標志物[16-18]。對喉癌患者腫瘤組織樣本中miRNA表達情況的研究發現，miR-885-5p是區別喉癌組織與正常黏膜組織的最佳生物學指標[19]。但目前針對血清miRNA表達水平對喉癌診斷價值的系統報道較少。

本研究首先通過miRNA表達譜芯片檢測篩選出LSCC患者異常表達的miRNA分子，其中miR-31、miR-141、miR-149a、miR-182、miR-485-3p、miR-122、miR-33、miR-205顯著升高；miR-133a、miR-223、miR-145顯著降低。目前miR-31與LSCC關系的報道較少見，但有報道稱，食管癌患者血清miR-31過表達與疾病復發、腫瘤特異性生存時間顯著相關[20]。研究證實，癌細胞中miR-182升高，且miR-182升高與p53過表達密切相關，可促進頭頸部鱗狀細胞癌患者體內癌細胞的增殖和轉移[21]。本研究中，LSCC患者血清miR-145表達水平顯著降低，可作為食管癌患者的腫瘤抑制因子，此外，血清miR-133a和miR-223亦顯著降低，與Gao等[22]的研究結論相似。有研究表明，miR-145、miR-133a、miR-223可直接調控致癌基因FSCN1的表達，參與食管鱗癌的發生和發展[23]。但有研究表明，胰腺腫瘤患者血清miR-223表達水平顯著升高[24]，本研究則得出不一致的結論。以上研究的差異性可能與不同研究的標本選擇、病例來源以及生存環境等有關。吸煙、飲酒以及人乳頭瘤病毒感染是喉癌的重要致病因素[25]。吸煙、飲酒等生活習慣可引起miRNA表達改變，導致不同研究結果的差異。本研究未探究miRNA表達水平與患者生存預后的關系，仍需進行大樣本隊列研究來進一步探究可用于評價LSCC患者療效及其預后的有效生物標志物。

綜上所述，血清miRNA的穩定性較高，便于取樣，易于檢測，具有很高的臨床應用價值；LSCC患者和健康者的血清miR-31、miR-33、miR-205存在明顯差異，可能成為診斷LSCC的有效生物標志物。