天麻舒心方對自發性高血壓大鼠動脈管壁形態、AngⅡ、Ang（1-7）的影響

劉坤， 徐貴成， 王卉， 單雅蒙， 潘立敏， 王洋

（中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053）

高血壓是諸多心腦血管疾病的重要危險因素，它的發病機制復雜，目前普遍認為，腎素—血管緊張素系統（renin angiotensin system，RAS）是其關鍵環節[1-2]，對維持血壓及微環境穩定具有重要作用[3]。長期的血壓升高在早期可累及小動脈，隨著病情進展逐漸遷延中動脈、大動脈，導致全身動脈系統的血管重塑（vascular remodeling，VR）。血管重塑常伴隨多種細胞適應性反應，血管平滑肌細胞與內皮細胞在長期的壓力負荷下分泌炎癥相關因子和血管活性物質，并產生細胞外基質沉積[4-5]，從而導致血管壁增厚、管腔狹窄、血管硬化等病理生理改變，進而引起心、腦、腎等靶器官損害[6]。相關研究[7]證實，作為RAS重要的效應分子，血管緊張素（Ang）Ⅱ通過與相關受體結合，對血管壁細胞產生多種作用，如促進細胞表型轉換，血管平滑肌細胞增殖、遷移等，參與血管重塑的過程。Ang（1-7）是內源性多肽激素，由AngⅠ、AngⅡ在血管緊張素轉換酶2等作用下產生，具有擴張血管、抑制血管平滑肌增殖等作用，可以修復高血壓、心肌缺血、心衰等引起的心臟損害[8]。天麻舒心方具有活血通絡、平肝益腎、滋陰潛陽等功效，前期研究顯示其在降壓的同時具有改善阻力血管富營養重塑作用[9-10]。本研究以阻力血管腸系膜三級動脈為切入點，以自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）模型為研究對象，觀察具有平肝活血作用的天麻舒心方的降壓作用及改善血管重塑作用，并探討其可能機制，為其臨床應用提供科學依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SHR大鼠75只，Wistar大鼠16只，鼠齡14周，體質量200～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養于中國中醫科學院廣安門醫院動物中心，環境設施符合二級動物（清潔動物CL）標準。

1.2 實驗藥物 天麻舒心浸膏液（方由天麻、牛膝、牡蠣、赤芍、防己、玄參、水蛭、澤瀉組成），由中國中醫科學院廣安門醫院制劑室生產。西藥對照組用藥為氯沙坦鉀（科素亞）混懸液，杭州默沙東制藥有限公司生產。

1.3 主要實驗試劑與儀器125I試劑盒，由北京華英生物技術研究所生產。r-911全自動放免計數儀，由中國科技大學實業總公司提供，檢測單位：北京華英生物技術研究所；BP-100A全自動大小鼠無創血壓測量箱，由成都泰盟軟件有限公司生產；Nicon Ti-U倒置相差顯微鏡（日本尼康公司）。

1.4 藥物制備 天麻舒心浸膏液：中藥材煎煮提取，制備提取液。濃縮提取液，收膏冷庫保存。

1.5 分組與給藥方法 SHR大鼠75只，隨機分為5組，每組15只，設為模型對照組，西藥對照組，中藥高、中、低劑量組；Wistar大鼠16只，設為正常對照組。中藥高、中、低劑量組給予天麻舒心浸膏液（劑量分別為11.16、5.58、2.79 g·kg-1·d-1，對應相當于成人用生藥量的50、25、12.5倍）灌胃；西藥對照組給予氯沙坦鉀混懸液（劑量為17.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；模型對照組及正常對照組給予同體積蒸餾水灌胃。每日1次。共18周。

1.6 鼠尾動脈壓測量 采用BP-100A全自動大小鼠無創血壓測量箱。將大鼠尾部置于尾袖中，于箱內預熱15 min，依照軟件操作流程測量大鼠清醒安靜狀態下尾動脈的收縮壓，重復3次，取平均值。實驗開始及之后每2周測量1次。

1.7 腸系膜三級動脈形態學觀察 采用倒置相差顯微鏡及計算機圖像分析。灌胃18周后，處死動物并留取組織標本。用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術臺上，暴露腹主動脈。放血處死動物后，立即行腹主動脈插管，0.1 mg/mL硝普鈉充分擴張血管后，用加入伊紅的10%甲醛溶液在60～80 cm H2O柱壓下灌注固定血管6～12 h。取腸系膜三級動脈，常規脫水、包埋、切片（厚度6μm），蘇木素—伊紅（HE）染色。鏡下觀察血管形態，計算機圖像分析測定管腔外徑、管腔內徑、中膜厚度、中膜厚度/內腔徑比、血管壁（中膜）/腔面積比及管壁厚度/管腔半徑比。

1.8 血漿、血管組織AngⅡ、Ang（1-7）含量測定 采用125I放射免疫分析法。給藥18周后，處死動物并采血，將樣本置于酶抑制劑抗凝管中，迅速冷卻搖勻，以1 000 r/min離心5 min，分離血漿。處死動物后分離腸系膜上動脈，組織勻漿。125I放射免疫分析法測定血漿、腸系膜上動脈組織、AngⅡ、An（g1-7）水平。

1.9 統計方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，數據結果以均數±標準差(-x±s)表示，多樣本均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SHR及Wistar大鼠血壓動態監測結果 表1結果顯示，給藥前，模型對照組血壓水平高于正常對照組（P＜0.01），提示高血壓模型確立，無藥物干預下，SHR血壓水平隨鼠齡增加呈上升趨勢。給藥2周后，西藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組血壓均顯著低于模型對照組（P＜0.01）；給藥14周后，各中藥組及西藥對照組血壓均顯著低于模型對照組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血壓動態監測比較Table 1 Comparison of the monitoring ambulatory blood pressure in various groups （-x±s，P/mmHg）

2.2 天麻舒心方對SHR阻力血管形態學的影響 圖1、表2結果顯示，與正常對照組比較，SHR中膜橫斷面面積未見明顯改變（P＞0.05），管腔外直徑、管腔內直徑顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），中膜厚度、中膜厚度/內腔半徑顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，西藥對照組和中藥各劑量組管腔內直徑增加（P＜0.05或P＜0.01），中膜厚度、中膜厚度/內腔半徑顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 天麻舒心方對SHR血漿及阻力血管AngⅡ含量的影響 表3結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組血漿AngⅡ水平顯著增高（P＜0.01），血管AngⅡ水平增高（P＜0.01）；與模型對照組比較，各給藥組血漿及血管局部AngⅡ水平無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 天麻舒心方對SHR血漿及阻力血管Ang（1-7）含量的影響 表4結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組血漿和血管Ang（1-7）水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，中藥高、中劑量組血漿Ang（1-7）顯著升高（P＜0.01），中藥高、中、低劑量組及西藥對照組血管局部Ang（1-7）顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 各組大鼠阻力血管形態學變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the morphological changes of resistance vessels in various groups（by HE staining，×100）

3 討論

血管重塑通常是較長時期的血流動力學改變造成的，可導致血管疾病和循環障礙，其最初過程可以是適應性的，但最終因失代償而導致靶器官功能損害[11]。血管平滑肌細胞是血管壁的主要組成細胞，參與維持血管的正常功能和結構完整，可以通過影響細胞生長、凋亡、重組、遷移、炎癥等促進血管重塑[12]。腎素—血管緊張素系統中，AngⅡ是血管緊張素原的連續酶促切割的產物，循環的腎素將肝臟來源的血管緊張素轉化為AngⅠ，然后由血管緊張素轉化酶裂解形成AngⅡ[13]。長期受到AngⅡ的刺激可導致全身動脈系統的血管重塑[14]。AngⅡ刺激黏附分子、趨化因子和細胞因子的表達，促進內皮功能障礙、氧化、低密度脂蛋白的攝取和血管平滑肌細胞的增殖，血管重塑的過程大部分由AngⅡ調節的轉錄因子控制，且在血管重塑的發生過程中，細胞外基質蛋白增加也受到AngⅡ的影響。本研究中，給藥18周后處死動物，對各組大鼠進行腸系膜三級動脈HE染色，檢測管腔內直徑、中膜厚度等，發現與正常對照組比較，SHR中膜橫斷面面積未見明顯改變（P＞0.05），而管腔外直徑、管腔內直徑顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），中膜厚度、中膜厚度/內腔半徑顯著增加（P＜0.01），證實了在AngⅡ高水平的持續作用下，血管壁發生了血管重塑，組織局部AngⅡ增高可能是高血壓阻力血管重塑的可能機制之一。

表2 各組大鼠腸系膜三級動脈形態學指標比較Table 2 Comparison of the indexes of morphological changes of three-layered mesenteric artery in various groups (-x±s)

表3 各組大鼠血漿、腸系膜三級動脈AngⅡ含量比較Table 3 Comparison of the content of AngⅡin plasm and three-layer mesenteric artery in various groups (-x±s)

表4 各組大鼠血漿、腸系膜三級動脈Ang（1-7）含量比較Table 4 Comparison of the content of Ang（1-7）in plasm and three-layer mesenteric artery in various groups (-x±s)

AngⅡ是腎素—血管緊張素系統中具有生物活性的下游肽，可以轉化為更小的、具有調節血管張力和管壁結構功能的肽類，如Ang（1-7）等[13]。Ang（1-7）廣泛存在于循環和組織中，是AngⅡ的內源性拮抗劑，經AngⅠ和AngⅡ由一系列催化反應生成[15]，通過介導血管舒張、生長抑制、抗炎反應、抗心律失常和抗血栓形成來對抗AngⅡ作用[16]。有研究[17]證實，Ang（1-7）能夠拮抗AngⅡ激活其作用通路，從而達到對心肌和血管內皮的保護作用。本研究中，與正常對照組比較，模型對照組血漿和血管Ang（1-7）水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，中藥高、中劑量組血漿Ang（1-7）顯著升高（P＜0.01），中藥高、中、低劑量組及西藥對照組血管局部Ang（1-7）顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。上述結果提示Ang（1-7）水平降低可能是SHR血壓升高、血管重塑進而靶器官損害的病理機制之一，具有平肝活血作用的天麻舒心方可增加整體及阻力血管局部的Ang（1-7）含量。

近年來，中醫藥在改善血管重塑方面的研究取得了一些進展，有研究[18]顯示，中藥復方能夠降低SHR血壓，明顯降低動物血漿AngⅡ水平，改善血管重塑。另有實驗[19]證實，中藥復方可通過減少小動脈增厚、平滑肌肥厚和增殖來防止血管重塑。前期研究[9-10，20-21]已證實，天麻舒心方可有效降低收縮壓及舒張壓，改善頸動脈重構，并從超微結構改善高血壓阻力血管富營養重塑，其作用與對RAS的抑制有關。本研究中，相對于模型對照組，西藥對照組和中藥各劑量組管腔內直徑增加（P＜0.05或P＜0.01），中膜厚度、中膜厚度/內半徑顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），提示具有平肝活血作用的天麻舒心方能夠改善血管重塑，且該作用可能是通過增加Ang（1-7）水平實現的。

綜上所述，SHR腸系膜三級動脈發生了血管重塑，組織AngⅡ水平持續升高可能是造成血管重塑的機制之一，Ang（1-7）水平增高可能改善血管重塑，天麻舒心方不僅可以控制血壓水平，而且可能通過增加整體及阻力血管局部的Ang（1-7）水平發揮降低血壓及改善高血壓阻力血管重塑的作用，達到進一步減輕高血壓靶器官損害的目的，為早期干預高血壓靶器官損害提供了新的思路。