菟絲子—黃芪治療骨質疏松癥的網絡藥理學機制研究

黃紅， 林燕平， 黃佳純， 黃宏興

（1.廣州中醫藥大學護理學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；3.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東廣州 510375）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種與年齡相關的常見病，其特征是骨量降低、骨組織顯微結構破壞，易致骨脆性增加及骨折風險增加[1]。預計到2050年，全世界60歲及以上的老年人口數將會從2000年的6億增加到20億[2]。隨著世界人口老齡化的加速，OP已成為人類社會的“公敵”。OP及其相關疾?。ㄖT如骨質疏松性骨折、肌少癥、糖尿病、高血壓等）不僅嚴重影響老年人群的生存質量，而且也給社會帶來沉重的經濟和醫療負擔。目前，現代醫學治療OP主要應用骨健康基本補充劑、骨吸收抑制劑及促進骨形成劑等[3]，但由于西藥不良反應多、價格昂貴、患者年齡大、基礎疾病多等因素，患者依從性差，沒有長期用藥，治療作用有限。因此，從傳統中藥中尋找安全、有效、價廉、不良反應少的中藥治療OP成為當前研究的熱點[4-6]。

菟絲子—黃芪常見于治療OP的方劑中[7-9]，具有補腎健脾益氣的作用。多項研究表明，菟絲子黃酮可能通過抑制成骨細胞凋亡抗OP[10-12]，黃芪多糖、黃芪甲苷可能通過多種機制抗OP[13-16]。但中藥所含成分復雜，作用靶點廣泛，這些研究僅側重于某一成分研究，不能全面評價中藥多成分的作用機制?；诰W絡藥理學的理論[17]，整合中藥、中藥活性成分、中藥靶標及疾病靶標等信息，構建中藥—成分—疾病—靶標調控網絡，可為全面研究中藥治療OP的作用機制提供理論基礎。本研究基于網絡藥理學的理論及方法，對菟絲子—黃芪治療OP的作用機制進行探討，以期為進一步的實驗研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 菟絲子—黃芪的有效成分及靶標篩選 中藥系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP）是一個提供藥物、疾病和靶標之間關系的數據庫[18]，該數據庫為中藥有效成分作用機制的研究提供了平臺。首先檢索TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得菟絲子—黃芪的有效成分，其中檢索條件[19]為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）≥ 0.18。然后應用Perl軟件（V5.26.3）和UniProt知識庫（https：//www.uniprot.org/）為篩選出的靶標添加基因名。

1.2 OP相關靶標的獲取 以“osteoporosis”為關鍵詞，檢索并篩選GeneCards數據庫（https：//genealacart.genecards.org/）的疾病相關靶標，得到OP相關靶標。

1.3 中藥—疾病靶標的構建 利用R語言軟件（V3.5.3）將OP相關靶標映射到菟絲子—黃芪靶標，得到中藥—疾病共同靶標的韋恩圖，從中得到中藥—疾病靶標。

1.4 中藥—成分—疾病—靶標調控網絡的構建 將“1.1”項獲得的菟絲子—黃芪靶標和“1.3”項獲得的中藥—疾病靶標利用Perl軟件進行一一映射，然后利用Cytoscape軟件（V3.7.1）進行計算，得到中藥—成分—疾病—靶標調控網絡。其中節點的類型有中藥、成分、疾病和中藥—疾病靶標。

1.5 中藥—疾病靶標蛋白相互作用網絡（PPI）的構建與核心靶標的篩選 應用STRING在線軟件（https：//string-db.org/）將中藥—疾病靶標輸入軟件，篩選條件為種屬選擇“Homo sapiens”，最小互作分數值為0.4，保存相應結果文件。將所得文件輸入R語言計算，得到PPI核心靶標的條圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將中藥—疾病靶標利用R語言軟件計算，得到基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菟絲子—黃芪有效成分的篩選和靶標預測結果 根據篩選條件：OB≥30%，DL≥0.18，檢索TCMSP數據庫中菟絲子—黃芪所有已報道的有效成分及其相關靶標，排除在UniProt知識庫中找不到對應基因名的靶標，共獲得有效成分21個，有效成分對應的靶標196個。見表1。

表1 通過TCMSP數據庫對菟絲子—黃芪所有成分根據OB和DL參數進行篩選后的結果Table 1 The results of screening all ingredients of Herba Cuscutae-Radix Astragaliby OB and DL parameters in TCMSP database

2.2 中藥—疾病靶標構建的結果 利用R語言軟件將OP相關靶標與菟絲子、黃芪靶標取交集，得到中藥—疾病共同靶標的韋恩圖，從中得到中藥—疾病靶標127個。其中OP疾病相關靶標3 126個，菟絲子靶標102個，黃芪靶標94個。見圖1。

2.3 中藥—成分—疾病—靶標調控網絡構建的結果 圖中紅色代表OP，藍色代表中藥菟絲子—黃芪，綠色代表菟絲子—黃芪的有效成分，黃色代表中藥—疾病共同靶標。中藥菟絲子—黃芪含有的21種有效成分主要通過127個靶標來影響OP的發生。其中，作用最明顯的2種成分是槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）。見圖2。

圖1 中藥—疾病靶標Figure 1 TCM-disease targets

圖2 中藥—成分—疾病—靶標調控網絡Figure 2 The regulatory network of TCM-ingredientdisease-target

2.4 中藥—疾病靶標PPI構建與核心靶標篩選的結果 據圖4可知，中藥—疾病核心基因按鄰接節點數目由多到少依次為IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、AR、FOS、ERBB2、 PPARG、 RELA、 PGR、 CAV1、 AHR、HIF1A、CD44、ICAM1、VCAM1、CASP9、PLAU、RB1、CCNB1、CYP3A4、ESR2、IGFBP3、IGF2、NFKBIA、NQO1。鄰接節點數目越多，成為核心基因的概率越大。見圖3、4。

2.5 GO功能富集分析 菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標的GO功能富集分析結果見圖5。菟絲子—黃芪治療OP的核心基因的GO功能主要涉及轉錄激活活性、轉錄因子活性、輔因子結合活性、核受體活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、類固醇結合等。

圖3 中藥—疾病靶標蛋白相互作用網絡Figure 3 TCM-disease target protein protein interaction（PPI）network

圖4 中藥—疾病核心靶標的條圖Figure 4 Barplot of TCM-disease core target

2.6 KEGG通路富集分析 菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標的KEGG通路富集分析結果見圖6。菟絲子—黃芪治療OP的核心基因的KEGG通路主要涉及：前列腺癌信號通路、糖尿病并發癥的晚期糖基化終末產物—晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、結直腸癌信號通路、乙肝信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、小細胞肺癌信號通路、EB病毒感染信號通路、內分泌失調信號通路、催乳素信號通路、細胞凋亡信號通路、麻疹信號通路、胰腺癌信號通路、乳腺癌信號通路等。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖Figure 5 Dotplot for GO functional enrichment analysis

綜合有關OP信號通路的文獻研究發現，前列腺癌信號通路[20-22]、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路[23]、動脈粥樣硬化信號通路[24-28]、結直腸癌信號通路[29-30]、乙肝信號通路[31-32]、TNF信號通路[33-35]、小細胞肺癌信號通路[36]、內分泌失調信號通路、細胞凋亡信號通路[37-39]、乳腺癌信號通路[40-41]等均參與OP的發病。

圖6 KEGG通路富集分析柱狀圖Figure 6 Barplot for KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

本研究基于網絡藥理學的理論，通過構建“中藥—成分—疾病—靶標”網絡圖，并對中藥—疾病靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，表明中藥菟絲子—黃芪含有的21種有效成分主要通過127個靶標來影響OP的發生。中藥菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標主要有IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、 AR、 FOS、 ERBB2、 PPARG、 RELA、PGR、 CAV1、 AHR、 HIF1A、 CD44、 ICAM1、VCAM1等，這些靶標可能通過影響轉錄激活活性、轉錄因子活性、輔因子結合活性、核受體活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、類固醇結合等參與OP的發生。

中藥菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標涉及的通路包括前列腺癌信號通路、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化信號通路、結直腸癌信號通路、乙肝信號通路、TNF信號通路、小細胞肺癌信號通路、內分泌失調信號通路、細胞凋亡信號通路、乳腺癌信號通路等。劉流等[42]對前列腺癌患者行去勢術，觀察前列腺癌去勢術與OP的關系，發現前列腺癌去勢術后血清睪酮的急劇下降與OP的發病明顯相關，表明前列腺癌與OP的發生有關。大量流行病學研究[25]表明，OP與動脈粥樣硬化性疾病具有密切的聯系，二者可能存在共同的發病機制，例如存在于脈管中的骨代謝標志物（骨鈣素、骨形態發生蛋白、骨橋蛋白和骨保護素）可能引起動脈粥樣硬化，而引起動脈粥樣硬化的炎性因子（NF-κB和一氧化氮）具有調節骨代謝的作用。左輝[29]對結直腸癌合并幽門螺桿菌感染患者檢測血中1型膠原氨基端前肽（PINP）、1型膠原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）的水平，發現結直腸癌患者血中PINP和β-CTX低表達，OP發病風險增加。以上研究從不同的發病機制說明OP與多種疾病的發病相關，多種疾病可以通過多種信號通路影響OP的發病。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法全面系統分析了中藥菟絲子—黃芪治療OP的作用機制，中藥菟絲子—黃芪通過調控OP相關的基因，OP相關的基因在機體內外環境的綜合影響下表現出相應的表型，即發病或不發病。本研究為中藥菟絲子—黃芪治療OP的有效成分及靶標的篩選提供了理論依據，但仍需結合體內外實驗進一步驗證有效成分及靶標的作用機制，以期提高中藥藥效，促進中藥現代化發展。