舒正顆粒對2型糖尿病大鼠糖脂代謝異常PI3K/AKT信號通路的影響

陸梓華， 呂雄， 曹明滿， 畢建璐， 黃艷麗

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣東廣州 510095；3.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)，廣東廣州 511400；4.珠海市第二中醫(yī)院，廣東珠海 519125）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為基礎的一種代謝性疾病，除有血糖的異常外，常伴有脂質代謝的紊亂。研究[1]證實，糖尿病顯著和持續(xù)的高血糖所造成的糖毒性以及脂毒性是引起或加重IR和胰島素分泌下降、胰島β細胞功能衰竭的原因。胰島素作用最重要的靶器官是肝臟，其主要通過促進糖原合成、增加葡萄糖攝取、減少葡萄糖輸出和糖異生等作用來調控血糖并維持血糖穩(wěn)定。胰島素通過與胰島素受體相結合，可激活其下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，再作用于肝臟等靶器官而發(fā)揮調節(jié)血糖的作用。PI3K/AKT信號通路異常，是2型糖尿病發(fā)生的基本機制[2]。舒正顆粒是第五批全國名老中醫(yī)藥學術經驗繼承工作導師呂雄教授創(chuàng)立的調節(jié)糖脂代謝紊亂的有效經驗方，前期臨床觀察表明舒正顆粒能有效調節(jié)糖尿病糖脂代謝異常狀態(tài)，改善微循環(huán)的灌注障礙[3-5]，但其機制有待進一步闡明。因此，本研究擬探討舒正顆粒對2型糖尿病大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路的作用，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雌性大鼠70只7～8周齡，體質量200～220 g，為廣東醫(yī)學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002。于廣東省第二中醫(yī)院中藥藥理（毒理）實驗室分籠喂養(yǎng)，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。

1.2 藥物 舒正顆粒，由生曬參、白術、茯苓、桃仁、布渣葉、麥冬等11味中藥組成，廣東省第二中醫(yī)院制劑室生產，批號：粵20071356；鹽酸二甲雙胍片，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H20023370，規(guī)格：0.5 g/片。

1.3 主要試劑與儀器 空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（中生北控生物科技有限公司）；HbA1c試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；10%水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠）；β-actin抗體、胰島素受體底物2（IRS2）抗體、PI3K抗體、AKT2抗體（英國Abcam公司）；叉頭框蛋白O1（FoxO1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；PierceTMBCA蛋白分析試劑盒（500 mL）、ECL發(fā)光檢測試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、定量DNA PCR試劑盒（美國Thermo公司）。IQTM5型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；JJ3000動物電子稱（美國G&G公司）；Bio-Rad680酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Milli QPlus超級純水儀（美國Millipore公司）。

1.4 分組與造模方法 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組（10只）與造模組（60只）。正常組以普通飼料喂養(yǎng)。造模組大鼠以高脂飼料（按質量分數(shù)配比：豬油20%、蔗糖5%、果糖5%、膽固醇5%、thyreostat 1%、鹽6%、味精1%、丙二醇30%、吐溫80 20%）喂養(yǎng)2周后，空腹單次腹腔注射STZ（30 mg/kg），檢測大鼠尾靜脈血，以隨機血糖≥16.7 mmol/L判斷2型糖尿病模型復制成功。再繼續(xù)高脂喂養(yǎng)6周[6-7]以維持、強化胰島素抵抗狀態(tài)，并使血脂進一步紊亂。造模共8周，其中10只大鼠造模失敗。將造模成功的50只大鼠隨機分為5組，即模型組，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 給藥 造模結束后，舒正顆粒高、中、低劑量組給予舒正顆粒灌胃（劑量分別為5.40、2.70、1.35 g·kg-1·d-1）。二甲雙胍組給予二甲雙胍（劑量為1.80 g·kg-1·d-1）灌胃。正常組與模型組給予等容積蒸餾水，并始終以脂肪乳灌胃。藥物干預4周。給藥劑量參考人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表[8]和《實驗動物學》[9]制定。

1.6 檢測指標及方法[10]

1.6.1 生化指標 FPG檢測采用葡萄糖氧化酶法；FINS、HbA1c檢測采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）；TC含量檢測采用膽固醇氧化酶—過氧化物酶偶聯(lián)（COD-PAP）法；TG含量檢測采用甘油磷酸氧化酶—過氧化物酶（GPO-PAP）法；HDL-C檢測采用過氧化氫酶清除法；LDL-C檢測采用表面活性劑清除法。

1.6.2 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量 操作步驟：稱取每只大鼠肝臟組織10 mg，每組共100 mg作為一個樣品，每個樣品每個目的蛋白重復試驗4次。往各蛋白樣品加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后提取總蛋白，并按照BCA試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，根據(jù)所測定的蛋白濃度決定上樣量。依次按配膠、電泳、轉膜、封閉的順序，使提取的蛋白與目的蛋白抗體結合并免疫雜交，最后將雜交產物條帶放入Tanon 5200 Multi成像系統(tǒng)中進行顯影成像。計算目標蛋白的相對表達量：分析目的蛋白條帶灰度值，并以β-actin條帶灰度值為參考，計算目標蛋白灰度值/內參灰度值（p）。

1.6.3 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相對表達量 操作步驟：（1）稱取每只大鼠肝臟組織100 mg，加入1 mLTrizol裂解液，冰上充分研磨勻漿，經氯仿、體積分數(shù)75%乙醇清除雜質后提取總RNA，測定吸光度（D）（260 nm）/D（280 nm）比值，計算RNA的濃度和純度。（2）逆轉錄成cDNA。按照總RNA 1μg，Olig（odT）15 1μL，隨機引物1μL，ddH2O加至12μL。繼而5×逆轉錄Buffer 4μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL，10 mMdNTPMix 2μL，ddH2O 1μL配制總體積為20μL的反應體系進行逆轉錄。（3）PCR擴增。基因的引物由美國invitrogen公司設計提供（見表1）。按照 Template（cDNA）1 μL、MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 μL、Former primer 1μL，Rear primer 1μL，dd H2O 9.5μL，總體積為25μL的擴增體系進行PCR擴增，循環(huán)條件：94℃×5 min；94℃×30 s→55℃×30 s→72℃ × 50 s（45個循環(huán)）；72℃ × 7 min。（4）采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量，計算公式為：F=2-（[待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值）]。

表1 PCR基因引物信息Table 1 Data of PCR gene premier

1.7 統(tǒng)計方法 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。符合正態(tài)分布資料，組間比較采用方差分析，總體均值統(tǒng)計先進行Levene's方差齊性檢驗，方差齊時采用SNK法，方差不齊則采用Dunnett T3檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 舒正顆粒對糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影響 見表2。與正常組比較，模型組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，舒正顆粒各劑量組及二甲雙胍組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均顯著降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 舒正顆粒對糖尿病大鼠血脂水平的影響 見表3。與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C水平均顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒各劑量組及二甲雙胍組大鼠TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），且舒正顆粒中、高劑量組調節(jié)血脂的作用優(yōu)于二甲雙胍組（P＜0.01）。

表2 舒正顆粒對T2DM大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影響Table 2 The effects of Shuzheng Granules on the levels of FPG，HbA1c，F(xiàn)INS in T2DM rats (-x±s)

表3 舒正顆粒對T2DM大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響Table 3 The effects of Shuzheng Granules on the levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C in T2DM rats[-x±s，c/（mmol·L-1）]

2.3 舒正顆粒對T2DM大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相對表達量的影響 見表4。與正常組比較，模型組肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒高劑量組及二甲雙胍組的IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表達均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），舒正顆粒中、低劑量組AKT2 mRNA表達升高，F(xiàn)oxO1 mRNA表達降低（P ＜0.01），IRS2、PI3K mRNA表達亦升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與二甲雙胍組比較，除舒正顆粒中、低劑量組IRS2、PI3K mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）外，舒正顆粒高、中、低劑量組的IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 舒正顆粒對T2DM大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影響 見表5、圖1。與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)oxO1蛋白含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒高劑量組及二甲雙胍組的IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)oxO1蛋白含量顯著降低（P＜0.05），舒正顆粒中劑量組IRS2、AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差異不顯著（P＞0.05），舒正顆粒低劑量組AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），IRS2、PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差異不顯著（P＞0.05）；與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），舒正顆粒中劑量組IRS2蛋白含量表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），PI3K、AKT2蛋白含量表達降低（P＜0.05），F(xiàn)oxO1蛋白含量表達升高（P＜0.01），舒正顆粒低劑量組IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量表達均顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)oxO1蛋白含量升高（P ＜ 0.01）。

表4 舒正顆粒對T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表達的影響Table 4 The effects of Shuzheng Granules on the mRNA expression levels of IRS2，PI3K，AKT2，F(xiàn)oxO1 in T2DM rats （-x±s，p）

表5 舒正顆粒對T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影響Table 5 The effects of Shuzheng Granules on the protein contents of IRS2，PI3K，AKT2，F(xiàn)oxO1 in T2DM rats (-x±s)

圖1 β-actin、IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白Western blot條帶圖Figure 1 Western blot strips ofβ-actin，IRS2，PI3K，AKT2，F(xiàn)oxO1 proteins

3 討論

T2DM屬中醫(yī)“消渴病”范疇。呂雄教授[11]結合中醫(yī)理論及其臨床經驗，認識到對消渴病的認識不應局限于陰虛燥熱、三消辨證，而獨創(chuàng)氣血肝脾理論，提出脾損致消、肝郁致消、濁毒瘀滯等觀點，認為消渴病為本虛標實之證，以脾氣虧虛為本，濁毒瘀滯為標，治療應以扶正祛邪為則，益氣化濁、祛瘀通絡為大法。舒正顆粒由生曬參、茯苓、白術、澤瀉、川芎、桃仁、丹參、麥冬、布渣葉、薤白、決明子等藥物組成。方中君藥生曬參益氣健脾，扶正祛邪，治病以求本，臣以白術、茯苓、澤瀉燥濕健脾，健脾寧心，與君藥合用，實為取四君子湯之益氣補虛之意；丹參、川芎、桃仁行氣活血，化瘀通絡，布渣葉、決明子化濁消滯，清熱利濕，再加薤白通陽散結，麥冬養(yǎng)陰清熱，以制約生曬參、川芎、薤白之燥熱。諸藥用之，共奏益氣化濁、祛瘀通絡之功。

PI3K/AKT信號通路是胰島素的主要下游分子通路，與細胞生長、分化、增殖、凋亡及葡萄糖轉運密切相關，該通路異常是胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)生的基本機制[2]。IRS2是維持胰島β細胞功能的重要信號蛋白，胰島素與胰島素受體結合后，會導致其自身的磷酸化并使IRS2酪氨酸位點磷酸化。磷酸化的IRS2酪氨酸殘基與PI3K的調節(jié)亞基p85結合，進而激活下游的PI3K。活化的PI3K將磷脂酰肌醇一磷酸轉化為磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作為其第二信使激活AKT。活化的AKT同時可以使FoxO1磷酸化并繼而失活，降低糖異生基因G6P及PEPCK水平，從而減少糖異生，最終使血糖降低[12-13]。

本研究結果顯示，舒正顆粒能顯著降低2型糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS、TC、TG、LDL-C，并使HDL-C明顯上升，說明舒正顆粒可以改善糖尿病糖脂代謝異常狀態(tài)。與模型組比較，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組IRS2的蛋白含量及mRNA的表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠IRS2的表達，從而發(fā)揮改善胰島素分泌及胰島素抵抗的作用，與黃琦等[14]得出的二甲雙胍能上調糖尿病大鼠肝臟IRS2結果相符。與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組上調糖尿病大鼠IRS2表達無差異，考慮舒正顆粒對IRS2的影響與二甲雙胍效果相似；且舒正顆粒中、低劑量組IRS2表達與二甲雙胍組有差異，考慮舒正顆粒對IRS2影響呈一定的劑量依賴性。與模型組比較，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組PI3K表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠PI3K的表達，與程靜等[15]提出的二甲雙胍能夠增加肝臟組織PI3K表達的結論相符，且二甲雙胍組與舒正顆粒高劑量組調節(jié)PI3K表達效果無統(tǒng)計學差異，考慮舒正顆粒對PI3K的作用與二甲雙胍效果相似。與模型組比較，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組AKT2表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠AKT2的表達，與李建中[16]研究顯示的二甲雙胍能上調大鼠AKT2蛋白含量的結果相符，且舒正顆粒高劑量組與二甲雙胍組結果無統(tǒng)計學差異，考慮舒正顆粒對糖尿病大鼠肝臟AKT2的作用與二甲雙胍相似；舒正顆粒中、低劑量組與二甲雙胍組比較具有統(tǒng)計學差異，說明舒正顆粒作用于大鼠肝臟AKT2需要達到一定劑量濃度效果才更佳。與模型組比較，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組大鼠肝臟FoxO1 mRNA表達顯著降低，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組FoxO1蛋白表達降低，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能下調糖尿病大鼠FoxO1的表達，與劉桐言[17]提出的二甲雙胍能抑制FoxO1表達的結論相符；且舒正顆粒高劑量組與二甲雙胍組無統(tǒng)計學差異，考慮舒正顆粒對FoxO1的抑制作用與二甲雙胍相似。

綜上所述，舒正顆粒能提高2型糖尿病大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路相關蛋白的活性，有效改善糖尿病大鼠糖脂代謝異常狀態(tài)，其效果呈一定的劑量依賴性。