益氣養陰疏肝合劑通過Fas/FasL途徑治療大鼠橋本氏甲狀腺炎

李嬋， 孫勤國

[武漢大學同仁醫院（武漢市第三醫院）中醫科，湖北武漢 430062]

橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病之一。其特征是存在高滴度的抗甲狀腺球蛋白（Tg）和抗甲狀腺過氧化物酶（TPO）的自身抗體，同時伴有甲狀腺淋巴細胞的浸潤，最終導致甲狀腺功能減退和甲狀腺組織纖維化。自1995年在全國范圍實施食鹽碘化以來，加之現代生活節奏的加快，甲狀腺疾病的發病率有所提高[1-3]，而且橋本氏甲狀腺炎可發生于任何年齡段[4]。然而，橋本氏甲狀腺炎的發病機制仍然沒有完全闡明。目前，西醫針對橋本氏甲狀腺炎主要采用替代療法和免疫療法[5]。甲狀腺激素替代療法能彌補甲狀腺激素缺失的問題，但不能從病因解決問題，且無免疫調節作用，不能降低較高水平的甲狀腺自身抗體。在橋本氏甲狀腺炎病程早期，糖皮質激素可以進行免疫調節，然而停藥反彈率高，長期或大劑量使用副作用較大且患者的耐受性較差。因此，西醫治療橋本氏甲狀腺炎的副作用大，復發率高，遠期療效欠佳[6]。而雷公藤多苷片能有效治療橋本氏甲狀腺炎[7]，但其具有較強的毒性，其低毒高效制劑的開發仍在探索中。結合橋本氏甲狀腺炎的臨床證候特征我們總結了以黃芪90 g、白芍30 g、墨旱蓮30 g、鬼箭羽30 g、郁金30 g、玄參30 g等中藥組成的益氣養陰疏肝合劑，有明顯臨床療效。因此，本研究建立實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型，并給予益氣養陰疏肝合劑治療，觀察益氣養陰疏肝合劑對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清炎性細胞因子水平的影響，探討益氣養陰疏肝合劑對橋本氏甲狀腺炎的治療機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級SD雌性大鼠60只，4～6周齡，體質量（110±10）g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養地點和實驗單位為湖北中醫藥大學動物實驗中心。飼養環境通風良好，溫度保持在20～24℃，喂養方式采用自由攝食、飲水，定期清洗鼠籠。

1.2 藥物 益氣養陰疏肝合劑組成中黃芪、白芍、墨旱蓮、鬼箭羽、郁金、玄參等中藥材購自湖北中醫藥大學附屬醫院湖北省中醫院中藥藥房。每mL生藥含量2.73 g，低溫冷藏備用。雷公藤多苷片，10 mg/片，100片/瓶，由貴州漢方藥業有限公司生產，批號：國藥準字Z52020369。

1.3 試劑與儀器 碘化鈉（NaI）購自上海羽朵生物科技有限公司（中國）；牛甲狀腺球蛋白（bTg）、弗氏完全免疫佐劑和弗氏不完全免疫佐劑均購自上海羽朵生物科技有限公司（中國）；甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）、甲狀腺過氧化酶抗體（TPOAb）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒和Fas、FasL免疫組化試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司。352型酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司）。

1.4 分組與造模 將60只SD雌性大鼠隨機分為正常組（N=15只）、造模組（N=45只）。實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型復制方法：造模組飲用高碘水濃度為0.64 g/L，連續2周。雙足皮下多點注射由完全弗氏佐劑（CFA）充分乳化成油包水狀的甲狀腺球蛋白（TG）（TG∶CFA=1∶1），每只大鼠注射100μg，注射2次，2次注射時間間隔2 d，作為初次免疫。之后，于后背皮下多點注射由不完全弗氏佐劑（IFA）乳化的TG，每只注射100μg，每周1次，連續4周，作為加強免疫[8]。將成模后的大鼠隨機分為模型組、中成藥組和中藥合劑組，每組各15只。

1.5 給藥 給藥方法和劑量按人和動物體表面積折算[9]的等效劑量比值表計算出大鼠等效劑量。中藥合劑組給予益氣養陰疏肝合劑煎液（劑量為21.4 g·kg-1·d-1）灌胃；中成藥組給予雷公藤多苷片懸濁液（劑量為6.25 mg·kg-1·d-1）灌胃；模型組及正常組灌服等量蒸餾水。每天給藥1次，連續6周。

1.6 蘇木素—伊紅（HE）染色法觀察大鼠甲狀腺病理變化 將大鼠甲狀腺組織經過脫水，包埋于蠟塊中，以6μm的厚度均勻切片。石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染核7 min，流水沖洗2 h，以1%的鹽酸酒精溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10 min，體積分數95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.7 ELISA法檢測血清TGAb、TPOAb、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12含量 治療后第42天腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采全血，以3 000 r/min離心15～20 min取血清。具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μL，然后再加生物素標記的抗體10μL。將樣品加于酶標板孔底部，混勻。每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。揭掉封板膜，棄液體，滌液5次。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，混勻，37℃避光顯色10 min。加終止液50μL，終止反應。在酶標儀上以540 nm的波長檢測吸光度（D）值，繪制標準曲線，根據樣品的吸光度值和標準曲線得出各組大鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12的含量。

1.8 免疫組化法檢測甲狀腺組織Fas/FasL表達 腹腔注射過量戊巴比妥鈉（100 mg/kg）后，處死大鼠，取甲狀腺組織，浸泡在甲醛溶液中，石蠟包埋。石蠟切片常規脫蠟和水化后，浸于0.01 mol/L枸櫞酸溶液（pH為6.0），微波爐中火10 min進行抗原修復。滴加體積分數3%H2O237℃恒溫箱孵育15 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗2次，體積分數10%正常山羊血清封閉，恒溫孵育15 min，去血清，滴加一抗，4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育30 min，滴加DAB顯色液2～4 min，控制顯色，沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度。自來水溫和沖洗20 min后，封片。高倍視野下觀察Fas/FasL陽性細胞細胞核，胞漿呈棕黃色顆粒為陽性染色細胞。觀察全片，無免疫染色陽性的標本記為0分；免疫染色陽性細胞較少，彌散分布的樣本記1分；而免疫陽性細胞較多，分布密集記2分；免疫陽性細胞多于60%則記3分。

1.9 統計方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示。若符合正態分布及方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗法；若不符合正態分布及方差不齊，采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠甲狀腺病理變化 圖1結果顯示：正常組大鼠甲狀腺濾泡呈規則橢圓形或圓形，甲狀腺上皮細胞排列均勻、整齊，無淋巴細胞浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡消耗明顯，呈現扁平形，大小不等，濾泡形狀不規則，內有漿細胞浸潤，甲狀腺上皮細胞排列紊亂，見明顯淋巴細胞浸潤。中藥合劑組、中成藥組大鼠甲狀腺病理表現較模型組有所緩解，可見上皮細胞排列較均勻、整齊，淋巴細胞浸潤減少。

圖1 各組大鼠甲狀腺病理變化（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of pathological features in rat thyroid of various groups（by HE staining，×200）

2.2 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平比較 表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TGAb、TPOAb水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥合劑組和中成藥組血清TGAb、TPOAb水平均顯著降低（P＜0.05），且中藥合劑組與中成藥組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of TGAb and TPOAb in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.3 各組大鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α、IL-10水平比較 表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的IL-6、TNF-α水平均顯著升高，IL-12、IL-10水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥合劑組和中成藥組的IL-6、TNF-α水平均顯著降低，IL-12、IL-10水平均顯著升高（P＜0.05），而中藥合劑組與中成藥組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織Fas、FasL表達比較 圖2、3及表3結果顯示，模型組大鼠甲狀腺組織Fas、FasL表達水平顯著高于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，中藥合劑組、中成藥組Fas、FasL表達水平顯著降低（P＜0.05），且中藥合劑組與中成藥組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

TGAb、TPOAb不僅是甲狀腺自身免疫反應的重要指標，同時也是橋本氏甲狀腺炎臨床診斷、治療及預后的重要依據。TGAb和TPOAb可通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用或與補體依賴的細胞毒作用損傷甲狀腺細胞，最終破壞甲狀腺細胞導致橋本氏甲狀腺炎患者出現甲狀腺功能減退[10]。Prummel等[11]發現TPOAb抗體水平與促甲狀腺激素（TSH）水平和甲狀腺組織中淋巴細胞浸潤密切相關。在亞臨床甲狀腺功能減退的患者中存在升高的抗TPO滴度有助于預測其向明顯的甲狀腺功能減退進展[12]。因此，降低TGAb、TPOAb是橋本氏甲狀腺炎的一個重要目標。本研究結果顯示，模型組血清2種抗體TGAb、TPOAb均明顯高于正常組，表明動物造模成功；而中藥合劑組及中成藥組血清TGAb、TPOAb等2種抗體均明顯下降，表明益氣養陰疏肝合劑和雷公藤多苷片對于橋本氏甲狀腺炎均有良好的治療效果。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10水平比較Table 2 Comparison of the serum levels of IL-6，IL-12，TNF-αand IL-10 in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

圖2 各組大鼠甲狀腺組織Fas表達比較（免疫組化法，×400）Figure 2 Comparison of Fas expression in rat thyroid of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖3 各組大鼠甲狀腺組織FasL表達比較（免疫組化法，×400）Figure 3 Comparison of FasL expression in rat thyroid of various groups（by immunohistochemistry，×400）

表3 各組大鼠甲狀腺組織Fas、FasL表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of Fas and FasL in rat thyroid of various groups (-x±s)

橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺細胞凋亡蛋白Fas表達增加，FasL是Fas在人體內的抗原配體，屬于腫瘤壞死因子家族。當Fas與FasL結合，將信號傳遞到胞質區，致Fas的死亡域結構活化，Fas/FasL能引起的甲狀腺破壞，是引起甲狀腺功能減退的原因之一[13-14]。FasL是Fas在人體內的天然配體，Fas和FasL相互作用是誘導細胞凋亡的重要途徑。本研究結果顯示，中藥合劑組甲狀腺組織Fas/FasL的表達顯著低于模型組，表明益氣養陰疏肝合劑可顯著降低Fas/FasL的表達。

TNF-α、IL-6和IL-12均為Th1型細胞因子，而IL-10為Th2型細胞因子。Th1因子產生高水平的干擾素γ（IFN-γ），而這種促炎癥細胞因子促進巨噬細胞活化，進一步生產TNF-α、IL-1、IL-6和活性氧等炎性介質而導致甲狀腺組織的破壞[15]。本研究結果還顯示，造模成功后的模型組血清TNF-α和IL-6顯著高于正常組，IL-10水平則顯著低于正常組，提示橋本氏甲狀腺炎特征是Th1細胞因子的水平升高，而Th2細胞因子的水平降低，亦證實了Th1介導細胞免疫應答在橋本氏甲狀腺炎中占主導作用[16]，由Th2細胞因子產生的IL-10水平的升高及Th1細胞因子產生的TNF-α水平的下降[17]。IL-10可以抑制活化T淋巴細胞，減少甲狀腺內CD4+和CD8+淋巴細胞數量，抑制淋巴細胞甲狀腺浸潤，并防止甲狀腺濾泡細胞的破壞[18]。在模型組中IL-12含量的下降可能是由于機體的炎癥反應導致。細胞因子的變化顯示了藥物干預機理可能與Th1/Th2平衡學說有關[19]。Th1/Th2細胞亞群漂移狀態與自身免疫性甲狀腺炎關系密切，若恢復Th1/Th2平衡狀態，可以達到治療某些特定疾病的目的[20-22]。本研究中，在造模成功后，顯示模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平升高同時伴IL-10水平下降，可見Th1/Th2發生了偏倚。而藥物干預后，TNF-α和IL-6水平的下降及IL-10水平的升高又改變了偏倚的狀態，使Th1/Th2之間恢復平衡，從而達到治療橋本氏甲狀腺炎的目的。

中醫學認為，橋本氏甲狀腺炎患者多因情志內傷，肝郁氣滯，致使臟腑、氣血功能失調，導致正氣虧虛，氣虛則血行無力，血行不利則血停為瘀而致頸前腫大[23-25]。而本研究方中重用黃芪補益元氣，為方中君藥。白芍養陰柔肝，墨旱蓮補益肝腎，玄參養陰散結，三藥配伍柔肝養陰散結，為方中之臣藥。鬼箭羽破血消瘕，郁金疏肝解郁，與白芍、墨旱蓮、玄參共治肝氣肝結，為方中之佐使藥。諸藥合用，共奏益氣養陰、疏肝解郁、消癭散結之功。益氣養陰疏肝合劑能顯著降低實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清TGAb、TPOAb的水平和甲狀腺組織Fas/FasL的表達，并通過調節Th1/Th2的平衡，提高自身免疫水平，緩解橋本氏甲狀腺炎的癥狀。