茯苓酸抑制TRIM29表達通過Wnt信號通路調控宮頸癌細胞存活和凋亡

申利， 翁丹卉

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院婦產科，湖北武漢 430077；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，湖北武漢 430030）

宮頸癌是世界范圍內女性第二大常見惡性腫瘤，死亡率較高，人乳頭瘤病毒（HPV）篩查是降低宮頸癌發病率的主要手段[1-2]。中藥在減輕放化療副作用和促進宮頸癌細胞凋亡等方面發揮較好的效果，對提高患者生存質量起到了很重要的作用[3]。茯苓酸（pachymic acid）是中藥茯苓的主要有效成分之一[4]。研究[5-8]發現，茯苓酸對膽管癌、膀胱癌、胃癌和乳腺癌均有抑制作用，但其對宮頸癌的作用效果尚不清楚。三基序蛋白（TRIM）29是TRIM蛋白家族成員之一，與多種疾病（包括癌癥、炎癥性疾病、發育性染色體異常疾病等）有關[9-10]。TRIM29在宮頸癌中上調表達，與患者的不良預后相關[11]。TRIM29的表達影響宮頸癌細胞的存活[12]。因此，本研究以宮頸癌Caski細胞為研究對象，以不同濃度茯苓酸處理Caski細胞，觀察茯苓酸對Caski細胞存活和凋亡的影響及TRIM29基因在該機制中的作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑與儀器 人宮頸癌細胞系Caski購自美國ATCC細胞庫。中藥茯苓購自中藥材市場，由華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院申利副主任醫師鑒定。抗TRIM29、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）、細胞周期調節蛋白Cyclin D1、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、β-連環蛋白（β-catenin）、c-Myc蛋白抗體和抗βactin抗體購自美國Abcam公司；胰蛋白酶（trypsin）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide， DMSO）購 自 美 國 Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、實時聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。流式細胞儀購自美國BD公司，顯微鏡、全自動酶標儀及實時PCR儀購自美國Bio-Rad公司；BCA檢測試劑盒購自上海碧云天生物。

1.2 細胞培養 將宮頸癌Caski細胞接種于含體積分數10%FBS、1%青霉素—鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于濕度95%、37℃、體積分數5%CO2培養箱中常規培養。細胞培養至融合度達到90%左右，收集細胞，消化傳代。

1.3 藥物處理 根據文獻[8]的方法提取茯苓酸，檢測化合物波譜，確定其為茯苓酸。使用時溶于DMSO。待細胞培養至對數生長期時，以1×104個/mL接種于96孔板，過夜貼壁，然后加入茯苓酸（0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L），培養 48 h。DMSO組僅加入DMSO作為空白對照，正常對照（NC）組加入RPMI-1640培養基。

1.4 細胞轉染 待Caski細胞培養至對數生長期，用培養液稀釋為1×106個/mL，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，培養至細胞融合為一層時進行轉染。轉染分組：TRIM29沉默組（轉染si-con和si-TRIM29）；TRIM29過表達組（轉染pcDNA和pcDNA-TRIM29）；茯苓酸+pcDNA組和茯苓酸+pcDNA-TRIM29組分別是轉染后加入20.0μmol/L茯苓酸處理48 h。先用無血清Opti-MEM培養液稀釋脂質體Lipofectamine 2000和各組載體，之后取等體積脂質體和載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養好的細胞中，培養6 h，換成RPMI-1640培養基，轉染48 h，收集細胞，進行后續實驗。

1.5 指標檢測與方法

1.5.1 采用MTT法觀察細胞生存能力 收集培養至對數生長期的Caski細胞，接種于96孔板中（每孔1×104個細胞）。過夜培養后，分別加入終濃度為0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的茯苓酸。再繼續培養48 h，加入20μL MTT（5 g/L）。繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入150μL DMSO溶解甲瓚結晶，室溫振蕩5 min。酶標儀測定490 nm處的吸光度（D）值，按照公式計算生存率。公式：生存率（%）=實驗組D均值/正常對照組D均值×100%。

1.5.2 采用流式細胞術觀察細胞凋亡情況 各組Caski細胞經茯苓酸處理后，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，培養72 h；棄去培養液，胰酶消化，收集細胞，加入200μL binding buffer重懸細胞；再加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶（PI）混勻，室溫避光20 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.5.3 采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測Caski細胞TRIM29基因表達 收集茯苓酸處理或轉染48 h的各組Caski細胞，按照Total RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，-80℃保存。然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，反應程序為42℃ 30 min、70℃ 10 min。4℃放置10 min。以合成的cDNA為模板，按照實時PCR說明書進行反應，反應條件：95℃4 min，95℃40 s，58℃45 s，72℃30 s，40個循環，72℃10 min。TRIM29上游引物為5'-TGCGAGCTGCATCTCAAG C-3'，下游引物為5'-GGTGCTATGATTCTTGTGC TCC-3'。運用Bio-Rad PCR檢測系統進行數據分析。

1.5.4 采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Caski細胞 TRIM29、Caspase-9、Cyclin D1、GSK-3β、β-catenin、c-Myc蛋白的表達 收集轉染后經茯苓酸處理并培養48 h的各組Caski細胞，加入RIPA裂解液，重懸裂解細胞20 min，冰浴超聲破碎，收集蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉膜，室溫封閉2 h；加入稀釋的一抗（抗TRIM29 1∶1000、抗Caspase-91∶2000、抗Cyclin D1 1∶800、抗GSK-3β 1∶1 000、抗β-catenin 1∶1 000、抗c-Myc 1∶500和抗β-actin 1∶1 000），4℃孵育過夜，PBST洗膜3次；加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯色，曝光，顯影，定影，拍照，掃描。結果以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值（p）表示，β-actin為內參照。

1.6 統計方法 采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度茯苓酸對宮頸癌Caski細胞存活和凋亡的影響 以不同濃度（0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）茯苓酸處理Caski細胞。MTT實驗結果顯示：與DMSO組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸均可顯著降低宮頸癌Caski細胞存活率（P＜0.05），且組間下降差異顯著（P＜0.05）。隨著茯苓酸濃度的增加，細胞存活率呈遞減趨勢，具有顯著的劑量依賴性，見圖1-A。流式細胞術和Western Blot結果顯示：與DMSO組比較，隨著茯苓酸濃度的增加，細胞凋亡率呈顯著上升趨勢（P＜0.05），凋亡蛋白Caspase-9表達量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表達量呈顯著下降趨勢（P＜0.05），見圖1-B、-C、-D、-E。說明茯苓酸能夠抑制Caski細胞增殖，促進細胞凋亡，升高凋亡蛋白Caspase-9表達，抑制周期蛋白Cyclin D1表達。

2.2 不同濃度茯苓酸對宮頸癌Caski細胞TRIM29表達的影響 RT-qPCR和Western Blot實驗結果顯示：與DMSO組比較，茯苓酸 2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L組Caski細胞TRIM29 mRNA和蛋白表達量呈依次遞減趨勢，且組間下降差異顯著（P＜0.05），具有劑量依賴性，見圖2。說明茯苓酸能夠抑制Caski細胞中TRIM29 mRNA和蛋白的表達。

根據以上實驗結果，選取處理時間48 h，對Caski細胞抑制效果最好的茯苓酸濃度（20.0μmol/L）用作后續實驗。

2.3 沉默TRIM29表達對宮頸癌Caski細胞存活和凋亡的影響 Western Blot、MTT和流式細胞術結果顯示：與si-con組比較，si-TRIM29組的TRIM29蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），凋亡相關蛋白Caspase-9表達量顯著增加（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表達量顯著下降（P＜0.05），細胞存活率顯著下降（P＜0.05），細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），見圖3。說明沉默TRIM29可促進凋亡蛋白Caspase-9表達，抑制Cyclin D1表達，抑制細胞存活，促進細胞凋亡。

2.4 過表達TRIM29部分逆轉茯苓酸對宮頸癌Caski細胞存活和凋亡的作用 Western Blot、MTT和流式細胞術結果顯示：與DMSO組比較，茯苓酸組TRIM29蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），凋亡相關蛋白Caspase-9表達量顯著增加（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表達量顯著下降（P＜0.05），細胞存活率顯著下降（P＜0.05），細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）；與茯苓酸+pcDNA組比較，茯苓酸+pcDNA-TRIM29組的TRIM29蛋白表達量顯著上升（P＜0.05），凋亡相關蛋白Caspase-9表達量顯著下降（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表達量顯著上升（P＜0.05），細胞存活率顯著上升（P＜0.05），細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），見圖4。說明過表達TRIM29可部分逆轉茯苓酸對宮頸癌Caski細胞存活和凋亡的作用。

圖1 不同濃度茯苓酸對Caski細胞存活、凋亡及凋亡相關蛋白、增殖相關蛋白表達的影響Figure 1 Effects of pachymic acid at different concentrations on cell survival，apoptosis，proliferation-related proteins and apoptosis-related proteins in Caskicells

圖2 不同濃度的茯苓酸對Caski細胞TRIM29 mRNA和蛋白表達的影響Figure 2 Effects of pachymic acid（PA）at different concentrations on the mRNA and protein expression levels of TRIM29 in Caskicells

圖3 降低TRIM29表達對Caski細胞存活、凋亡的影響Figure 3 Effects of down-regulation of TRIM29 on cell viability and apoptosis of Caskicells

2.5 過表達TRIM29對茯苓酸處理的宮頸癌Caski細胞Wnt信號通路的影響 Western Blot結果顯示：與DMSO組比較，茯苓酸組β-catenin蛋白表達量顯著上升（P ＜0.05），GSK-3β和c-Myc蛋白表達量顯著下降（P＜0.05）；與茯苓酸+pcDNA組比較，茯苓酸+pcDNA-TRIM29組β-catenin蛋白表達量顯著下降（P ＜0.05），GSK-3β和c-Myc蛋白表達量顯著上升（P＜0.05），見圖5。說明茯苓酸能夠促進Caski細胞Wnt信號通路中β-catenin蛋白表達，抑制GSK-3β和c-Myc蛋白表達，下調Wnt通路活性，過表達TRIM29逆轉了茯苓酸對Wnt通路的抑制作用。

3 討論

研究[13]發現，茯苓具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等功效，茯苓酸是茯苓的主要有效成分之一。Sun等[14]研究發現，茯苓酸可顯著抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，并以濃度依賴的方式誘導G0/G1細胞周期停滯。Wen等[15]研究表明，茯苓酸可顯著降低骨肉瘤細胞增殖，且呈濃度和時間依賴性，并以劑量依賴方式通過人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因/蛋白激酶B（PTEN/AKT）信號和Caspase 3/7活性介導細胞凋亡。本研究結果顯示，茯苓酸能夠抑制Caski細胞的增殖，促進Caski細胞凋亡，促進凋亡蛋白Caspase-9表達，抑制周期蛋白Cyclin D1表達，表明茯苓酸對宮頸癌有抑制作用。

TRIM29可通過抑制p53作用促進細胞增殖[16]。Qiu等[17]研究發現，TRIM29以癌基因形式在胃癌組織中大多呈高表達，miR-185可靶向抑制TRIM29和Wnt/β-catenin信號活性，抑制癌細胞。Xu等[11]發現，TRIM29在宮頸癌組織（4例）表達上調，與患者早期存活率有關。Zhang等[18]在用微衛星標記研究121例宮頸癌等位基因缺失時發現，TRIM29在宮頸癌組織和6個宮頸癌細胞系中都有表達。本研究結果顯示，茯苓酸能夠抑制Caski細胞中TRIM29 mRNA和蛋白表達，沉默TRIM29可促進Caspase-9表達，抑制Cyclin D1表達，抑制癌細胞存活，促進癌細胞凋亡，表明茯苓酸可通過抑制TRIM29表達誘導細胞凋亡，進而抑制宮頸癌。

圖4 過表達TRIM29部分逆轉茯苓酸對Caski細胞的抑制作用Figure 4 Overexpression of TRIM29 partially reversed the inhibitory effect of pachymic acid on cervical cancer Caskicells

圖5 茯苓酸對TRIM29過表達Caski細胞Wnt信號通路蛋白β-catenin、GSK-3β、c-Myc表達的影響（A、B）Figure 5 Effects of pachymic acid on the expression of Wnt signaling pathway proteins β-catenin，GSK-3β，c-Myc in Caskicells with TRIM29 overexpression（A，B）

Wnt通路與腫瘤的發生有關，其異常激活可導致細胞異常增殖和分化，Wnt/β-catenin通路是Wnt通路的經典模式，其核心因子β-catenin在腫瘤細胞質和細胞核中表達上調，在腫瘤細胞膜中經常不表達或缺失。β-catenin的異位表達可激活Wnt通路，下游靶基因c-Myc的大量表達表明Wnt通路被激活[19]。Yang等[20]總結發現，β-catenin是宮頸癌治療的重要靶點，也是預測宮頸癌放化療耐受性的標志物。本研究結果顯示，茯苓酸能夠促進宮頸癌Caski細胞Wnt信號通路中GSK-3β蛋白表達，抑制β-catenin和c-Myc蛋白表達，下調Wnt通路活性，過表達TRIM29逆轉了茯苓酸對Wnt通路的抑制作用。表明茯苓酸通過靶向TRIM29抑制Caski細胞中Wnt通路活性，抑制Caski細胞活性。

綜上所述，本研究首次闡述了在宮頸癌Caski細胞中，茯苓酸靶向TRIM29基因可抑制Wnt通路活性，促進凋亡蛋白表達，從而抑制Caski細胞增殖，促進Caski細胞凋亡，達到抑制宮頸癌的作用。認為茯苓酸對人宮頸癌具有潛在的治療作用。不足之處在于，本研究觀察了茯苓酸對宮頸癌細胞的作用，但尚未進行整體動物水平的研究。下一步本研究將進行茯苓酸抑制宮頸癌的動物藥理實驗，以進一步明確其在宮頸癌治療中的應用價值。