響應面法優化航天雜交構樹葉總黃酮提取工藝及體外抗弧菌活性研究

張志鵬， 蔡延渠， 梁煒祺， 董碧蓮， 吳燕紅， 陳必添， 馮華仔

（1.湖北科技學院藥學院，湖北咸寧 437100；2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東廣州 510006；3.陽江市金星種養產業研究院，廣東陽江 529500）

構樹（Broussonetia papyrifera L.vent）為桑科構樹屬的多年生落葉闊葉喬木，又名楮樹。航天雜交構樹是中國科學院植物研究所利用現代生物技術和傳統雜交育種方法，采取基因工程、新種質創制和航天搭載誘變等技術而培育出的多功能林木樹種[1]。“構樹扶貧工程”被列入2015年國家十大精準扶貧工程之一。

傳統中醫認為，構樹的乳液、根皮、樹皮、葉、果實及種子均可入藥，具有祛風、利尿、涼血、殺蟲解毒等功效；現代研究[2]表明，構樹具有抗真菌、抗氧化、抗血小板、抗肝細胞毒、酪氨酸酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制等生物活性，可用于治療真菌感染、癌癥、糖尿病等疾病，主要與構樹中的黃酮類成分密切相關。

弧菌病是水產養殖動物的常見疾病，引發的致病菌株主要有副溶血弧菌（V.prarhaemolyticus）、創傷弧菌（V.vulnificus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、鰻弧菌（V.anguillarium）和非01霍亂弧菌（V.cholerae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等[3]；同時抗生素的亂用、濫用，導致耐藥性及水體殘留量日益嚴重，影響了水產養殖業的可持續發展和綠色健康發展。黃酮類成分作為構樹的主要組成，目前在抗菌方面僅有抗鐮孢霉菌真菌[4]的活性報道。因此，本研究以航天雜交構樹葉為原料制備總黃酮，采用加熱回流提取法，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken響應面法進行工藝優化；同時以抑菌圈直徑、最低抑菌濃度評價總黃酮提取物及其不同溶劑萃取物在體外抗常見致病弧菌的活性，為構樹葉總黃酮及其活性成分的開發利用提供實驗依據，亦為航天雜交構樹品種的種植推廣提供新動力，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 藥材 航天雜交構樹葉樣品由陽江市金星種養產業研究院提供，經廣東藥科大學新藥研發中心吳燕紅高級工程師鑒定為桑科構樹屬構樹（Broussonetia papyrifera L.vent）的葉。

1.2 菌株 哈維弧菌（ATCC 33842）、副溶血弧菌（ATCC 17802-G1）、溶藻弧菌（ATCC 33787），由中國水產科學院研究院南海水產研究所提供；創傷弧菌（ATCC 27562）、非 01霍亂弧菌（GIM 1.449）、嗜水氣單胞菌（ATCC 35654），由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.3 試劑 95%乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；2216E瓊脂培養基、2216E液體培養基、營養瓊脂培養基、LB液體培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）。

1.4 儀器 UV-1700雙光束紫外分光光度計（日本島津公司）；EPED-10TF純水器（南京益普易達科技發展有限公司）；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DHP-9082恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；DHG-9140電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LX-B50L立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；JJ1000Y電子天平（美國雙杰集團有限公司）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；BHS-4數顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）。

2 方法與結果

2.1 航天雜交構樹葉總黃酮測定[5]

2.1.1 總黃酮樣品溶液制備 稱取干燥的航天雜交構樹葉粗粉約30 g，按料液比1∶20[（m/g）∶（V/mL），下同]加入體積分數50%乙醇，100℃加熱回流提取2次，1.5 h/次，趁熱過濾，濾液75℃減壓濃縮至適量，定容成1 g（生藥）/mL。吸取0.1 mL該藥液至10 mL容量瓶中，加入適量體積分數80%乙醇超聲5 min，定容，即得樣品溶液。

2.1.2 標準曲線繪制 稱取一定量的蘆丁對照品于10 mL容量瓶中，加入體積分數80%乙醇制備成質量濃度為1.160 mg/mL的標準溶液。分別吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL標準溶液于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，室溫靜置6 min；再加入5%Al（NO3）3溶液1.0 mL，室溫靜置6 min；再加入5%NaOH溶液2.5 mL，用體積分數80%乙醇定容，搖勻后放置15 min。以體積分數80%乙醇為空白參照，在500 nm處測定吸光度（D）值。以吸光度D值為縱坐標（Y）、蘆丁質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得回歸方程，Y＝10.994 5X-0.145 0，r＝0.997 7。結果顯示在0.023 2～0.092 8 mg/mL范圍內呈現良好線性關系。

2.1.3 精密度試驗 準確吸取0.5 mL質量濃度為1.160 mg/mL的標準溶液，平行6份，按“2.1.2”項下操作進行絡合反應后測定吸光度D值，計算得平均值為0.457，相對標準偏差（RSD，sR）=0.83%，結果表明儀器的精密性良好。

2.1.4 重復性試驗 準確吸取1.0 mL“2.1.1”項下的總黃酮樣品溶液，平行6份，按“2.1.2”項下操作進行絡合反應后測定吸光度D值，計算得平均值為0.420，sR=0.86%，結果表明該法的重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗 準確吸取1.0 mL“2.1.1”項下的總黃酮樣品溶液，平行3份，按“2.1.2”項下操作進行絡合反應。3 h內每隔0.5 h測定吸光度D值，計算得平均值為0.415，sR=1.29%，結果表明該樣品溶液在3 h內顯色反應穩定。

2.1.6 加樣回收率試驗 準確吸取0.7 mL“2.1.1”項下已知質量分數的總黃酮樣品溶液，平行6份，分別加入0.3 mL質量濃度為1.160 mg/mL的標準溶液，按“2.1.2”項下操作反應。測定吸光度D值，計算平均回收率為97.33%，sR為1.37%，結果表明該法的準確性良好。

2.1.7 航天雜交構樹葉總黃酮得率測定 吸取航天雜交構樹葉總黃酮溶液1.0 mL，按“2.1.2”項下操作進行反應后測定吸光度D值，代入回歸方程計算總黃酮質量。按以下公式計算其得率：航天表示總黃酮質量（g），M表示航天雜交構樹葉質量（g）。

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同乙醇濃度考察 稱取航天雜交構樹葉粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20分別加入體積分數40%、50%、60%、70%、80%乙醇，100℃加熱回流提取2次，2 h/次。結果顯示，乙醇濃度為40%～70%時，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮的溶出明顯增加，之后即使乙醇濃度增加，總黃酮得率僅略微提高。結果見圖1。

圖1 不同乙醇濃度對航天雜交構樹葉總黃酮得率的影響（n=3）Figure 1 Effects of different ethanol concentrations onthe yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.2 不同提取溫度考察 稱取航天雜交構樹葉粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入體積分數70%乙醇，于60、70、80、90、100℃加熱回流提取2次，2 h/次。結果顯示，隨著溫度的升高，總黃酮的溶出明顯增加，當溫度升至100℃時，得率最高。結果見圖2。

2.2.3 不同料液比考察 稱取航天雜交構樹葉粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入體積分數70%乙醇，100℃加熱回流提取1次，2 h/次。結果顯示，料液比在1∶10～1∶20間，隨著溶劑用量的增大，總黃酮的溶出明顯增多，之后即使加大溶劑量，得率僅略微提高。結果見圖3。

圖2 不同提取溫度對航天雜交構樹葉總黃酮得率的影響（n=3）Figure 2 Effects of different extraction temperatures on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

圖3 不同料液比對航天雜交構樹葉總黃酮得率的影響（n=3）Figure 3 Effects of different solid-liquid ratios on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.4 不同提取時間考察 稱取航天雜交構樹葉粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入體積分數70%乙醇，100℃加熱回流提取1次，0.5、1、2、3、4 h/次。結果顯示，隨著提取時間的延長，總黃酮含量隨著提高。在提取時間為0.5～2 h時，含量提高明顯；但在2～4 h內，增幅不明顯。結果見圖4。

圖4 不同提取時間對航天雜交構樹葉總黃酮得率的影響（n=3）Figure 4 Effects of different extraction time on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.5 不同提取次數考察 稱取航天雜交構樹葉粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入體積分數70%乙醇，100℃加熱回流提取1、2、3、4次，2 h/次。結果顯示，增加提取次數能夠明顯提高總黃酮含量，但是提取2次后，藥物已基本溶出完全。結果見圖5。

圖5 不同提取次數對航天雜交構樹葉總黃酮得率的影響（n=3）Figure 5 Effects of different extraction times on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.3 Box-Behnken響應面法優化[6-7]通過單因素試驗，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數（D），以總黃酮得率為評價指標，采用軟件Design-Expert 8.0進行4因素4水平Box-Behnken響應面試驗設計。因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應面法因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology test

通過對數據進行多元回歸擬合，得到航天雜交構樹葉總黃酮得率（Y）對4因素的回歸方程：Y=5.93+0.65A+0.29B+0.34C+1.28D-0.035AB+0.15AC+0.19AD+0.027BC+0.18BD+0.040CD-0.70A2-0.35B2-0.62C2-1.05D2。

2.3.1 回歸模型與方差分析 表3結果顯示，模型F值為32.74（P＜0.000 1），表明具有顯著性差異；同時失擬項值為3.44（P＞0.05），表明擬合度良好。相關系數R2為0.970 4及失擬項系數R2Adj為0.940 7，均表明模型預測值與實測值的相關性良好。由F值可知，因素A、B、C、D對航天雜交構樹葉總黃酮得率具有顯著性影響（P＜0.01），順序依次為A=D＞C＞B，但其相互間的交互項影響差異不顯著（P＞0.05），表明航天雜交構樹葉總黃酮與各個因子之間不單單是線性關系。二次項A2、B2、C2、D2影響顯著（均P ＜ 0.01）。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Regression analysis results of variance analysis

2.3.2 響應面圖分析 通過模型繪制各因素的等高線與響應面，分析結果可知，料液比與提取時間、提取次數三者間兩兩的響應面較為陡峭、等高線較為趨于橢圓形，表明因素間交互作用較為顯著。結果見圖6。

2.3.3 驗證試驗 由軟件分析所得的航天雜交構樹葉總黃酮最優提取工藝條件：乙醇濃度68.88%、料液比1∶20.09、提取時間1.99 h、提取2.48次，預測得率為6.21%。結合實際操作，確定最終優化方案：乙醇濃度70%、料液比1∶20、提取時間2 h、提取3次。重復3次試驗，總黃酮得率為（6.02±0.14）%，比預測值低了0.19%。表明該模型具有較好的預測性，優化所得工藝穩定可行。

2.4 航天雜交構樹葉總黃酮抗弧菌活性測定[8-9]

2.4.1 藥物制備 稱取航天雜交構樹葉粗粉200 g，按照最優工藝：乙醇濃度70%、料液比1∶20、提取時間2 h、提取3次，減壓濃縮至適量，平均分成兩份，進行不同處理：（1）將溶液進一步濃縮，定容成1 g（生藥）/mL的原藥液；（2）將藥液依次采用極性由低到高的有機溶劑進行萃取，即得不同部位的萃取物（石油醚層、二氯甲烷層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層），以1%二甲基亞砜溶液定容成1 g（生藥）/mL的藥液。

2.4.2 菌種復蘇及培養 將保存于-70℃的哈維弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌、非01霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌菌種取出，分別以接種環于2216E瓊脂板上劃線，37℃復蘇20 h。挑選形態良好的單菌落，于2216E液體培養基中37℃振蕩培養6 h，采用麥氏比濁管校正，最終稀釋成菌落數濃度為1×106CFU/mL的菌懸液。

2.4.3 抑菌圈直徑測定 采用K-B紙片法，先吸取1 g（生藥）/mL的原藥液及不同部位萃取物藥液各20μL于直徑7 mm的紙片上，50℃烘干，即得藥敏片。再吸取0.2 mL菌懸液于2216E瓊脂板上，涂勻，稍晾干，將各藥敏片等距離貼放于菌板表面，倒置于恒溫培養箱中37℃培養20 h，取出用游標卡尺測量抑菌圈直徑，重復3次試驗。結果判讀：抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感，7～12 mm為低度敏感，12～17 mm為中度敏感，＞17 mm為高度敏感。

圖6 不同因素交互作用對航天雜交構樹葉總黃酮得率影響的響應面與等高線圖Figure 6 Contour and response surface plots for the correlative effects of different factors on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves

分析表4結果可知，以生藥量計，航天雜交構樹葉總黃酮提取物的對弧菌的敏感度比各部位萃取物更強，對哈維弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、嗜水氣單胞菌表現出高度敏感，對溶藻弧菌、非01霍亂弧菌則表現出中度敏感。同時，經過不同極性有機溶劑萃取，活性物質主要集中于乙酸乙酯層和水層，其次是石油醚層，最弱的是二氯甲烷層和正丁醇層。

2.4.4 最低抑菌濃度（MIC）測定 采用微量稀釋法，將原藥液及不同部位萃取物藥液按倍比進行稀釋成系列濃度（0.98～1 000 mg/mL），分別吸取藥液及菌懸液各100μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100μL作陰性對照，置恒溫培養箱中37℃培養20 h。結果判讀：肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細菌生長者，即為該試菌MIC值。難判斷者，可將該孔中培養液于無菌瓊脂板上劃線，37℃培養20 h后讀取結果。

分析表5結果可知，航天雜交構樹葉總黃酮提取物抗弧菌活性較不同有機溶劑萃取物更強，其中對嗜水氣單胞菌最強，其次是副溶血弧菌，接著是哈維弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌，最弱的是非01霍亂弧菌。對于不同部位萃取物，以乙酸乙酯層及水層的活性最強，其次是石油醚層、正丁醇層，二氯甲烷層基本無抗弧菌活性。

表4 航天雜交構樹葉對不同弧菌的抑菌圈直徑Table 4 The diameters of inhibition zone of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia Papyrifera leaves on different vibrios （-x±s，d/mm）

表5 航天雜交構樹葉對不同弧菌的MIC值Table 5 The minimal inhibitory concentration of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia Papyrifera leaves on different vibrios[ρ/（mg·mL-1）]

3 討論

本研究采用Box-Behnken響應面法優選出航天雜交構樹葉總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度70%、料液比1∶20、2 h/次、100℃加熱回流提取3次。驗證結果顯示總黃酮得率與預測值接近，表明本模型所優選出的工藝穩定可行。

體外抗菌活性結果顯示，抑菌圈直徑與最低抑菌濃度之間具有正相關性，即抑菌圈直徑越大、MIC值則越低。表明航天雜交構樹葉總黃酮提取物具有較明顯的抗弧菌活性，強弱順序依次為嗜水氣單胞菌＞副溶血弧菌＞哈維弧菌=溶藻弧菌=創傷弧菌＞非01霍亂弧菌。通過采用不同極性的有機溶劑純化，發現活性物質主要集中于乙酸乙酯層及萃取后的水層，表明航天雜交構樹葉總黃酮提取物的抗菌活性是由不同極性成分間協同作用的結果。

因此，航天雜交構樹葉總黃酮可作為新的抗感染藥物嘗試防治水產養殖常見病害—弧菌病，不僅有利于提高種植戶種植航天雜交構樹的經濟效益及降低養殖戶因弧菌病害而引起的經濟損失，而且能夠進一步實現無抗或抵抗養殖、創造綠色健康食品的良好社會效益。