HT22海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型的建立

閆向麗， 王利勝， 王圣鑫

（廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006）

缺血性腦中風（ischemic stroke，IS）是一種因血管部分或完全阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的疾病，患者預后常伴有運動、語言等神經功能缺損癥狀，給社會和家庭帶來了沉重的負擔[1-2]。腦組織處于缺血缺氧的病理狀態下，大腦的結構和功能將出現嚴重的損傷和破壞，當用溶栓、擴血管等手段重新補給血液后，會進一步加劇腦組織的損傷并伴隨一系列的炎癥反應，引起再灌注損傷。氧糖剝奪再灌注（OGD/R）模型通過剝奪細胞的營養及氧氣供給模擬人體缺血再灌注損傷過程，是目前較為理想的體外實驗模型[3]。海馬對缺氧的耐受力較差，因此選擇海馬神經元細胞建立穩定的氧糖剝奪再灌注模型，對缺血性腦中風疾病的研究具有重要意義[4]。本研究以HT22海馬神經元細胞為研究對象，采用缺氧小室（見圖1）對細胞進行缺氧、不同時間的復氧建立氧糖剝奪再灌注模型，通過觀察細胞形態，檢測細胞存活率，同時測定不同條件下細胞培養基中乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量，確定最佳的造模條件，以期為研究缺血性腦中風疾病的研究建立一種穩定可靠的細胞模型，現將研究結果報道如下。

圖1 細胞缺氧培養裝置Figure 1 Hypoxia incubator chamber

1 材料與方法

1.1 細胞 HT22海馬神經元細胞由中國科學院上海藥物研究所惠贈。

1.2 試劑 DMEM高糖培養基（批號：8119078）、DMEM無糖培養基（批號：2044490）均購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司，批號：42Q0682K）、青霉素—鏈霉素（中國Biosharp公司，批號：68080500）、CCK-8（日本同仁化學研究所，批號：FH783）、LDH試劑盒（批號：20180728）、SOD試劑盒（批號：20180728）、MDA試劑盒（批號：20180728），均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 缺氧小室（加拿大Stem cell公司，型號：27310）；流量計（加拿大Stem cell公司，型號27311）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；恒溫CO2培養箱（新加坡Esco公司）；酶聯免疫檢測儀（美國BioTek公司）。

1.4 細胞培養 HT22細胞系是小鼠HT4細胞系的一種亞克隆，具有海馬神經元的特性，是一種永生化的小鼠海馬神經元細胞[5]。用含體積分數10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養基，同時加入100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，在37℃，體積分數5%CO2的培養箱中培養。

1.5 實驗分組及處理 細胞分為正常對照組和模型組，以9 000個/孔、5 000個/孔、3 000個/孔的密度接種至同一96孔板中，平行3份。正常對照組：細胞始終在正常氣體條件下培養；模型組：吸棄原細胞培養基，PBS清洗3次后加入DMEM無糖培養基，將96孔板置于缺氧小室中，混合氣體（體積分數95%N2+體積分數5%CO2）置換其中的空氣，之后將裝置放入37℃的培養箱中缺氧8 h。細胞缺氧結束后，將DMEM無糖培養基更換為完全培養基，并重新放入細胞培養箱中繼續培養，復氧時間分別設為3、6、8 h。

1.6 細胞計數試劑盒8（CCK-8）測定細胞活力 細胞處理結束，吸棄原培養基，PBS清洗3次后加入100μL完全培養基和10μL的CCK-8溶液，37℃孵育2 h，于酶標儀450 nm處測定吸光度（OD，D）值。用每組D（450 nm）值與正常對照組D（450 nm）值的比值（p）來計算細胞存活率。每個濃度設6個復孔，實驗重復3次。最后取平均值進行統計分析。

1.7 LDH、SOD活力及MDA含量測定 細胞處理結束，收集細胞上清液于新的96孔板中，微板法分別測定LDH、SOD的活力及MDA含量。每個濃度設6個復孔，實驗重復3次。結果取平均值進行統計分析。

1.8 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件，并使用Graphpad prism 5.0進行圖表繪制，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態的改變 倒置相差顯微鏡下可見，正常的HT22海馬神經元細胞輪廓清晰，立體感強、貼壁良好。氧糖剝奪再灌注后細胞突起皺縮、變圓，部分細胞漂浮在培養基中，細胞在再灌注6 h時受損最為明顯。結果見圖2。

圖2 不同造模條件下細胞的形態（×100）Figure 2 Cell morphology under different modeling conditions（×100）

2.2 氧糖剝奪再灌注對細胞存活率的影響 為探討不同接種密度、不同復氧條件對細胞存活率的影響，設定了不同的細胞接種密度及復氧時間。結果顯示，與正常細胞比較，不同接種密度的細胞在復氧6 h時存活率均達到最低（P＜0.05）。在相同的接種密度下，隨著復氧時間的延長細胞存活率均呈現出先降低后增加的趨勢。結果見表1。

2.3 氧糖剝奪再灌注對細胞培養基中LDH活力的影響 氧糖剝奪再灌注后，不同接種密度、不同復氧條件下，細胞培養基中LDH的活力都有所增加，其中不同接種密度的細胞在復氧6 h時培養基中LDH的活力最高（P＜0.05）。在相同的接種密度下，細胞培養基中LDH的活力均呈現先增高后下降的趨勢。結果見表2。

2.4 氧糖剝奪再灌注對細胞培養基中SOD活力的影響 氧糖剝奪再灌注后，不同接種密度、不同復氧條件下，細胞培養基中SOD的活力都有所下降，其中不同接種密度的細胞在復氧6 h時培養基中SOD的活力最低（P＜0.05）。在相同的接種密度下，細胞培養基中SOD的活力均呈現先下降后增高的趨勢。結果見表3。

表1 不同造模條件對細胞存活率的影響Table 1 The effects of different modeling conditions on cell viability （-x±s，n=3）

表2 不同造模條件對細胞培養基中LDH活力的影響Table 2 The effects of different modeling conditions on LDH activity in cell culture medium （-x±s，n=3）

表3 不同造模條件對細胞培養基中SOD活力的影響Table 3 The effects of different modeling conditions on SOD activity in cell culture medium （-x±s，n=3）

2.5 氧糖剝奪再灌注對細胞培養基中MDA含量的影響 氧糖剝奪再灌注后，不同接種密度、不同復氧條件下，細胞培養基中MDA的含量都有所增加，其中不同接種密度的細胞在復氧6 h時培養基中MDA的含量最高（P＜0.05）。在相同的接種密度下，細胞培養基中MDA的含量均呈現先增高后下降的趨勢。結果見表4。

3 討論

缺血性腦中風以其高發病率、高致殘率、高復發率的特點成為神經系統疾病的研究熱點。離體實驗具有周期短、研究條件易于控制等優勢，是研究腦梗死疾病的主要方式之一。然而，國內關于HT22海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型的建立尚無統一標準。據文獻報道，離體細胞模型的建立大體上分為化學方法和物理方法兩類[3]。化學性缺氧模型由于化學試劑的加入可能對細胞造成損傷且存在實驗操作不易控制、危害健康等問題；物理性缺氧模型比較常見，且應用廣泛，混合氣體培養法是目前建立細胞缺氧缺糖模型最常用的方法之一。Sun等[6]用三氣培養箱制備了HT22海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型，但由于價格昂貴，存在對機器的依賴性，一般實驗室難以普及[7]。

表4 不同造模條件對細胞培養基中MDA含量的影響Table 4 The effects of different modeling conditions on MDA content in cell culture medium （-x±s，n=3）

為了制備高效穩定的海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型以利于后續研究，本研究用缺氧小室對細胞進行缺氧處理，再設定不同復氧時間來制備細胞模型，同時檢測不同接種密度的細胞在氧糖剝奪再灌注后的存活率，旨在為缺血性腦中風疾病的機制研究提供可靠的細胞模型。CCK-8分析法具有很高的靈敏度，利用活細胞線粒體內的脫氫酶能選擇性地將四唑鹽還原成橙黃色甲瓚沉淀物的原理來檢測細胞的存活率。本研究結果表明，在預設的造模條件下，不同接種密度細胞的形態均呈現出相似的趨勢：細胞皺縮、變圓，部分細胞漂浮在培養基中，其中在復氧6 h時，細胞損傷最明顯，同時細胞活力達到最低。之后，隨著復氧時間的延長，細胞形態趨于正常，細胞活力逐漸恢復。

腦缺血再灌注時，機體內產生的氧自由基將加重腦損傷，SOD為氧自由基清除劑，過量的氧自由基會降低其活性[8]。再灌注過程產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，生成大量的脂質過氧化產物MDA，同時細胞膜的完整性受到破壞，通透性增加，胞漿內的LDH大量外漏[9-11]。由本實驗結果可知，不同的造模條件均對細胞造成了損傷，不同接種密度下的細胞在復氧6 h時，上清液中SOD的活性最低，說明此時機體內大量的氧自由基加重了腦損傷；LDH的活力及MDA的含量最高，表明細胞膜的完整性受到了嚴重的破壞。復氧8 h時，由于細胞的自身修復作用，各個生化指標呈現出逐漸恢復的趨勢。

氧糖剝奪再灌注細胞模型是模擬人體缺血再灌注的經典離體實驗模型。因此，建立穩定可靠的海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型對缺血性腦中風病理機制的研究具有重要意義。通過查閱文獻，我們發現研究者們在用不同的細胞建立氧糖剝奪再灌注模型時，缺氧時間有2、3、4、8、12 h 不等[6，10，12-14]。基于此，我們對缺氧時間進行了考察，發現缺氧8 h適合海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型的建立。陳強等[15]考察了不同再灌注時間（6、12、24 h）對大鼠腦內腦源性神經營養因子（BDNF）表達的影響，BDNF的表達水平反應了局部神經元抵抗損傷的能力。研究發現，再灌注12 h時，BDNF的表達水平最高，提示這可能是治療缺血性腦中風疾病的最佳時機。在預設的再灌注條件下，我們在細胞水平也發現了類似的趨勢，但在再灌注6 h時細胞損傷最嚴重，這可能是因為離體狀態下細胞的耐受力減弱所致。通過考察不同細胞接種密度對模型的影響，發現預設的3種細胞接種密度對海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型的建立沒有影響，可以根據實際需要選擇合適的細胞接種量。本實驗研究重復了3次，結果穩定。

綜上所述，我們將HT22海馬神經元細胞氧糖剝奪再灌注模型的建立條件初步確定為缺氧8 h復氧6 h，該方法操作簡單，穩定可靠，能很好地滿足缺血性腦中風疾病機制研究的實際需求。