版納微型豬近交系免疫排斥相關基因B4GALNT2的克隆、表達及功能生物信息學分析

宋 雪，王淑燕，陳園園，王 配，霍海龍，張 霞，霍金龍

(1.云南農業大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，云南 昆明 650201； 3.云南農業職業技術學院 教務處，云南 昆明 650031)

碳水化合物對糖蛋白和糖脂的修飾涉及多種生物學過程，包括蛋白質穩定性的維持、細胞識別、信號傳導、免疫應答等重要過程。碳水化合物在個體間及物種間修飾的差異，產生了一種免疫自我識別的機制[1]。異種器官移植過程中所產生的一系列免疫排斥反應便與這種免疫自我識別機制密切相關。例如人類和其他靈長類動物不產生α-1,3-galactose(αGal)這種末端半乳糖的寡糖，而其他哺乳動物卻可合成末端αGal多糖，當豬到靈長類動物異種器官移植時，靈長類動物受體會開啟免疫自我識別而產生高水平的抗Gal抗體，這是主要的異種器官移植的免疫屏障[2-4]。Sda(Sid)抗原是一種與任何其他已知血型系統無關的新抗原，Sda抗原的免疫顯性聚糖為N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)，是一種潛在的異種抗原，在抗體介導的排斥反應中起重要作用[5]。Byrne等[6-7]在豬到非人靈長類動物器官移植的探索時發現，非人靈長類動物異種移植后產生的抗體是針對一系列豬內皮細胞蛋白質和由豬B4GALNT2基因產生的聚糖[8]，而β1,4GalNAcT-Ⅱ在異種移植中可能參與抗體依賴性排斥反應，揭示β1,4GalNAcT-Ⅱ是一種誘導非人靈長類動物受體產生排斥反應的非Gal抗原[5,9]。

B4GALNT2屬于N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(N-acetylgalactosaminyltransferases，GalNAc-Tases)家族，該家族是一類非常重要的催化氧糖基化的初始酶，主要負責將供體二磷酸尿苷N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)上的GalNAc基團轉移至受體蛋白，與多肽鏈特定序列中的Ser或Thr羥基結合，從而構成O-聚糖[10]。目前已知該家族至少有14個成員，分別為GalNAc-T1-T14，各酶在多種組織中的分布和表達不同，功能也不盡相同。在對Sda抗原合成的研究中發現，該家族成員B4GALNT2是催化合成Sda抗原的關鍵酶，可催化N-乙酰半乳糖胺的末端添加到唾液酸修飾的半乳糖胺進而形成Sda血型抗原(GalNAcβ4[Neu5Acα2,3]Galβ4GlcNAcβ3Gal)[11]。有研究認為，通過免疫抑制可顯著影響誘導抗體應答的T細胞水平，從而降低T細胞依賴性和特異性，這對研究缺乏多種異種糖基合成的供體豬具有很大的前景[9]。

長期以來，ABH血型抗原在個體間表達的差異是難以進行輸血以及異種器官移植的主要原因。不表達特定ABH抗原的個體會受到腸道菌群的刺激，產生針對該聚糖的抗體，這種預先形成的抗體可誘導溶血反應，也可促進與ABH血型不相容的移植物的超急性排斥反應或者加速同種異體移植物的排斥反應[1]。Sda血型抗原與ABH血型抗原都屬于一類糖蛋白，兩者作用機制相似，Sda血型抗原并不只特定存在于紅細胞表面，還存在于移植肝的血管和肝竇的內皮細胞表面以及膽管上皮細胞表面。對豬B4GALNT2基因座的基因工程實驗證實了非人靈長類動物和人類抗體對B4GALNT2抗原具有依賴性，雖然Sda血型對輸血沒有顯著的排斥風險，但非人靈長類動物中觀察到的誘導抗體應答以及癌癥疫苗接種研究的結果表明，豬血管內皮細胞中B4GALNT2的表達可能對人類具有免疫原性[12]。

近交系動物不僅遺傳背景相似，還具有遺傳一致性和反應均一性等特點[13]，經基因改造后與人類的組織可具有較大的生物相容性[14]。BMI是遺傳背景清楚且基因高度純合的大型哺乳類動物近交系，其在異種器官移植方面具有重要的研究和應用價值[15-19]。本試驗克隆了免疫排斥相關基因B4GALNT2并研究了其在BMI中的mRNA和蛋白表達情況，利用生物信息學方法分析了其編碼的蛋白質的基本結構和功能特征，為進一步探索B4GALNT2在豬-人異種器官移植中的作用機制提供了試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和主要試劑

屠宰3只BMI，耳號為413、417和0847(昆明原種豬場)，對15個重要組織進行采樣，得到的(心、肝、脾、肺、腎、皮膚、回腸、盲腸、大腦、脊髓、淋巴結、扁桃體、腎上腺、甲狀腺、頜下腺)樣品速凍于液氮，后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。從北京寶日醫生物技術公司購置M-MLV逆轉錄酶、ExTaq酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑、pMD18-T載體，以及β-Tubulin(2H4)：鼠一抗(艾比瑪特生物醫藥公司，上海)，β-1,4-GalNAc-T2(Q-12)鼠一抗(Sauta Cruz公司，美國)，羊抗鼠二抗(KPL公司，美國)等試劑。

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

分別從BMI 15個組織中提取總RNA，經BioPhotometer核酸蛋白儀測定并電泳鑒定合格的RNA反轉錄為cDNA第一鏈，參考GenBank豬B4GALNT2mRNA序列(AY271355)，利用Premier 6.0和Oligo 7軟件設計3對特異引物，引物的名稱和序列、產物序列長、作用等信息見表1。

1.3 PCR擴增及基因克隆

使用引物 F1/R1(表1)，cDNA為模板，進行PCR。PCR擴增體系25 μL：ddH2O 5.75 μL、2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL、引物 F/R(10 μmol/L)各0.5 μL、模板(50 ng/μL) 1.5 μL、ExTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL。PCR運行條件設置：預變性(94 ℃，5 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(56 ℃，40 s)，延伸(72 ℃，2 min)，35次循環；后延伸(72 ℃，10 min)。電泳檢測擴增產物合格后，將目的條帶回收純化，連接克隆載體pMD18-T，轉化、復蘇、培養，挑取陽性單菌落，菌液PCR及測序鑒定。

1.4 多組織mRNA熒光表達譜檢測

選取GAPDH基因作為內參進行對照，使用引物F2/R2和GAPDH-F/GAPDH-R(表1)通過qPCR分析15個組織中B4GALNT2基因的mRNA水平。擴增體系20 μL：無RNAase ddH2O 6.4 μL、2×SYBR Green 10 μL、引物 F2/R2(10 μmol/L)各0.8 μL、cDNA模板 2 μL。運行程序：預變性(95 ℃，2 min)；變性(95 ℃，15 s)，退火(60 ℃，15 s)，延伸(72 ℃，20 s)，40次循環；采集熒光信號20 min。每個樣本重復3次，設置NTC，采用2-ΔΔCt法分析數據結果。

1.5 B4GALNT2蛋白Western Blotting分析

制備15種組織的蛋白樣品，以β-tubulin(54 ku)為內參蛋白進行Western Blotting分析。蛋白樣品濃度測定后，經過SDS-PAGE電泳、轉膜、暗室曝光和膠片處理等一系列蛋白免疫印跡試驗流程，得到最終試驗結果。

1.6 生物信息學分析

關于B4GALNT2蛋白質的分子質量(Mw)和等電點(pI)等理化特征的預測，以及CDS預測、蛋白序列推導等均通過在線軟件DNAStar來完成；B4GALNT2蛋白質的保守結構域、跨膜螺旋和信號肽的預測，分別借助CDART、TMHMM、SignalP 4.1預測網站完成；B4GALNT2蛋白質的二級結構和三級結構預測則通過SOPMA和SWISS-MODEL得到。將NCBI BlastP獲取的5個不同物種(牛、綿羊、人、大鼠和小鼠)的B4GANLT2蛋白序列，利用DNAStar、ClustalX和MEGA 7.0軟件與BMI B4GALNT2蛋白序列(ANH21179.1)進行同源比對及構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 B4GALNT2基因PCR擴增

F1/R1擴增的B4GALNT2基因的完整編碼區(CDS)及部分非編碼區(UTR)序列，片段大小為1 773 bp，與預期一致，電泳結果見圖1。對PCR產物原液和克隆后提取的陽性質粒進行雙向測序，獲得的BMIB4GALNT2的CDS序列長1 509 bp，GenBank登錄號為KU358546。

M．DNA相對分子質量標準DL2000； 1.引物F1/R1擴增的PCR產物。 M. Marker-DL2000; 1.PCR product amplified by primers F1/R1.

2.2 多組織mRNA熒光表達譜

經過對qPCR檢測結果的分析，B4GALNT2基因在15種組織中mRNA的表達情況見圖2。相對于內參GAPDH基因的表達水平，發現B4GALNT2mRNA在各組織中的表達均存在差異，其中在扁桃體、肺臟、淋巴結和脾臟中表達較高，且表達量極顯著高于盲腸、頜下腺等其他組織(P<0.01)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。 Different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.3 Western Blotting檢測結果

利用Western Blotting檢測分析得到B4GALNT2蛋白在15種組織中的表達情況。結果表明，BMI B4GALNT2蛋白在各組織中的差異表達，相對于內參蛋白β-tubulin，在扁桃體、腎上腺、盲腸、腎臟和甲狀腺中表達較高，并且扁桃體、腎上腺、盲腸3種組織中的表達量極顯著高于其他組織，見圖3。

M. EasySee Western Marker(25～90 ku)；1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.皮膚；7.回腸；8.盲腸；9.大腦； 10.脊髓；11.淋巴結；12.扁桃體；13.腎上腺；14.甲狀腺；15.頜下腺；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。 M.EasySee Western Marker(25-90 ku)；1.Heart; 2.Liver; 3.Spleen; 4.Lung; 5.Kidney; 6.Skin; 7.Ileum; 8.Caecum; 9.Cerebrum; 10.Spinal cord;11.Lymph node; 12.Tonsil; 13.Adrenal gland; 14.Thyroid gland; 15.Submandibular gland; Different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.4 B4GALNT2基因生物信息學分析

2.4.1B4GALNT2基因序列及其編碼氨基酸 獲得的BMIB4GALNT2基因CDS序列長1 509 bp，編碼502個氨基酸(圖4)，無信號肽序列，9-31 AA處含有1個跨膜螺旋結構，蛋白質分子質量56.73 ku，等電點為6.24。

ATG.起始密碼子；*.終止密碼子；上一行字母為編碼區序列，對應的下一行為其編碼的氨基酸序列； 橫線是Glyco tranf GTA type保守結構域(272-364 AA)；陰影為跨膜結構。 ATG.Start codon; *.Stop codon; The letters of upper line are CDS, and those of the corresponding line are amino acid sequences; The Glyco tranf GTA type conserved domains are underlined(272-364 AA) ； The transmembrane structure is shaded.

2.4.2 B4GALNT2蛋白質疏水性和保守結構域 BMI B4GALNT2蛋白經ProtScale分析，其最大疏水值為3.244，最小疏水值為-2.256，分別處于第18位氨基酸和第116位氨基酸處，N端和C端均親水。NCBI服務器CDART-BLAST預測的B4GALNT2蛋白的保守結構域見圖5，其中272-364 AA屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族成員。

圖5 BMI B4GALNT2蛋白質保守結構域Fig.5 The conserved domain of BMI B4GALNT2 protein

2.4.3 B4GALNT2蛋白質跨膜結構 利用TMHMM程序預測的B4GALNT2蛋白質跨膜結構(圖6)，存在1個9-31 AA的跨膜螺旋結構。

2.4.4 B4GALNT2蛋白質二級和三級結構 利用SOPMA程序預測的BMI B4GALNT2蛋白質二級結構，其中含α螺旋167 AA(33.27%)，延伸鏈結構96 AA(19.12%)，β轉角50 AA(9.96%)，無規則卷曲189 AA(37.65%)。通過SWISS-MODEL在線自動同源建模系統，試圖尋找與BMI B4GALNT2蛋白相似度高的三級結構模型。結果該系統提供了2個預測模板，模板1為2z87.1.A，一種軟骨素合酶，蛋白序列一致性為19.61%，覆蓋BMI B4GALNT2蛋白的254-459 AA，覆蓋率為41%；模板2為6h1j.1.C，一種可能的ss-1,3-N-乙酰葡糖氨基轉移酶，蛋白序列一致性為17.28%，覆蓋BMI B4GALNT2蛋白的256-458 AA，覆蓋率38%。

圖6 利用TMHMM程序預測的 BMI B4GALNT2蛋白的跨膜結構域Fig.6 The transmembrane structure of BMI B4GALNT2 protein predicted by TMHMM

2.4.5 B4GALNT2蛋白質序列多物種相似度計算及系統進化分析 BMI B4GALNT2氨基酸序列與下列5種物種：牛Cattle(XP_010814492)、羊Sheep(AGF33390)、人Human(NP_001152859)、大鼠Rat(XP_006220879)和小鼠Mouse(NP_032107)氨基酸序列相似度達到77.9%，75.9%，75.3%，69.3%，69.1%(圖7-A)?；谏鲜鑫锓N氨基酸序列同源性，構建系統進化樹以揭示各物種間的進化關系，結果表明共分為三大類：BMI與牛和羊聚為一類，而后與人聚為一類，大鼠與小鼠聚為一類(圖7-B)。

圖7 BMI B4GALNT2同源性分析和系統進化樹Fig.7 The homologous analysis and the phylogenetic tree of BMI B4GALNT2

3 討論

N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(GalNAc-Tases)家族成員，參與黏蛋白氧糖基化過程，氧糖基化蛋白主要見于分泌液中的糖蛋白，俗稱粘蛋白，與細胞的識別、細胞黏附、免疫、腫瘤轉移、精卵結合及細胞凋亡等生命過程密切相關[10,20]。組織血型抗原Sda也是一種氧糖基化蛋白，在紅細胞及多種組織中都有表達，雖然Sda血型對輸血沒有顯著排斥風險，但在豬到人的異種器官移植過程中，豬血管中B4GALNT2的表達可能使人產生免疫排斥反應。除免疫排斥外，Sda抗原還參與癌細胞分化、轉化，小鼠毒性T淋巴細胞的溶解，以及血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWf)循環半衰期的調節等過程[21-22]。近年來關于豬B4GALNT2基因及其蛋白的研究報道逐漸增多，在豬至狒狒心臟異種移植IgG受體的篩選中檢測到了豬B4GALNT2基因[6,23]，在豬大腸黏膜中檢測到了β1,4GalNAcT-Ⅱ酶活性并在豬原始生殖細胞中檢測到了Sda抗原[24-25]。敲除豬細胞中的B4GALNT2基因可清除Sda抗原上的GalNAc基團，進而降低人血清抗體與豬細胞的結合[5]。B4GALNT2基因在豬內皮細胞中表達并顯示出廣泛分布的表達模式[1]，有學者認為，使用豬主動脈內皮細胞(PAEC)膜蛋白質組學分析和PAEC cDNA文庫篩選方法可能有助于異種移植物排斥的免疫原性非Gal靶抗原的鑒定[6,26]。Byrne等[1]研究顯示，在受到大量免疫抑制的受體中，誘導的非Gal抗體應答與結合了HEK-B4T細胞的抗體之間存在相關性，特別是在人類HEK-B4T細胞中表達豬B4GALNT2基因，導致與抗Sda抗體的反應性增加，甚至會使補體介導的裂解敏感性增強20倍，進一步說明B4GALNT2與異種移植免疫排斥相關。

本研究首次獲得了BMIB4GALNT2基因CDS全長序列，包含1 509 bp，編碼502個氨基酸。在用熒光定量技術確定mRNA多組織表達譜時，由于單引物跨內含子并不能完全避免擴增基因組序列，從而減除基因組DNA對mRNA表達的影響，因此本研究設計了上下游引物同時跨越內含子的熒光定量引物，熒光定量PCR結果顯示BMIB4GALNT2mRNA在多種組織中廣泛表達，其中在扁桃體、肺臟、淋巴結和脾臟中表達相對較高。Western Blotting檢測顯示BMI B4GALNT2蛋白在扁桃體、盲腸、腎臟和甲狀腺中表達相對較高。結合以上兩項試驗結果可以初步推斷，B4GALNT2基因的表達主要集中于免疫相關組織。本研究中Western Blotting在蛋白水平的檢測結果與熒光定量PCR的mRNA表達結果存在一定差異，而這種差異的存在很可能是基因在先后經歷轉錄和翻譯2個過程中的表達量不同所造成的，具體機制還有待進一步研究[27]。

本研究預測的B4GALNT2在9-31 AA處含有1個跨膜螺旋結構，屬于跨膜蛋白，其N端和C端均親水，與人B4GALNT2蛋白研究結果相類似[28]。跨膜蛋白是存在于生物膜系統中的一種特殊蛋白，作為生物膜的主要組分，它們參與細胞及組織內外環境中頻繁的信息傳遞和物質交換，在生物體的生命活動中具有重要作用[29]。B4GALNT2是GalNAc-T家族成員之一，GalNAc-T家族屬于Ⅱ型單通道跨膜蛋白，其氨基酸的N端處于胞質中，包含一個15-25 AA氨基酸的穿膜錨定結構域，通過一個莖部與C端深入高爾基體管腔內大于450 AA的催化區相連接，這種結構可能在高爾基復合體內參與和其他蛋白質協調的相互作用，或者輔助催化結構域在高爾基體中的伸展，因此錨定結構域與糖基轉移酶的定位有關[30]。

蛋白質序列及其結構的相似性使得蛋白質分子在進化過程中具有一定的保守性[31-32]，因此，分析蛋白的保守結構域對于研究它們的功能是十分必要的，本研究對BMI B4GALNT2蛋白保守結構域預測結果表明272-364 AA屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族成員。蛋白質的二級結構不僅僅是蛋白質三級結構的組成單元，也是構成蛋白質復雜構象的重要基礎[33]。BMI B4GALNT2蛋白質二級結構的預測結果表明，以無規則卷曲(37.65%)和α-螺旋(33.27%)結構為主。蛋白質三級結構即蛋白質的空間結構，決定其生物學功能，預測蛋白質的結構對認識其結構與功能的關系具有重要意義。目前，同源模建(Comparative Modeling)即比較模建是蛋白質結構預測的方法中最為成功的一種方法[34]，通過SWISS-MODEL在線自動同源建模系統的分析預測，結果沒有搜索到與豬B4GALNT2相似性較高的三級結構序列模板，系統只提供了2個蛋白序列一致性較低的預測模板，分別為2z87.1.A(相似性19.61%)和6h1j.1.C(相似性17.28%)。

BMI B4GALNT2與牛、羊、人、大鼠和小鼠氨基酸序列相似度較高，而序列相似度越高，同源性越高，親緣關系就越近，6個物種的B4GALNT2氨基酸序列構建的分子系統進化樹表明BMI與牛和羊聚為一類，都屬于偶蹄目，而后與人聚為一類，大鼠與小鼠聚為一類，均為嚙齒目。系統進化樹結果與不同物種間基因序列相似度結果相符合。