結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙硫異煙胺/丙硫異煙胺耐藥的機(jī)制及其增敏劑研究進(jìn)展

宋艷華 高孟秋 李琦

耐藥結(jié)核病(MDR-TB)是全球結(jié)核病控制的重大挑戰(zhàn)。2019全球結(jié)核病播報(bào)數(shù)據(jù)顯示，全球估計(jì)約有48.4萬(wàn)例為新發(fā)的耐利福平結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)，其中有78%為MDR-TB。 中國(guó)是MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，和印度、俄羅斯3個(gè)國(guó)家占了全球1/2的MDR/RR-TB患者[1]。對(duì)一線核心抗結(jié)核殺菌藥品異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)耐藥的MDR-TB，需要二線抗結(jié)核藥物治療，WHO指南推薦4～5種抗結(jié)核藥品組成MDR-TB治療方案[2]。二線抗結(jié)核藥物因?yàn)椴涣挤磻?yīng)多、用藥不便、療效欠佳等局限性，往往導(dǎo)致不規(guī)律治療，增加產(chǎn)生廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的風(fēng)險(xiǎn)。研發(fā)新型有效的抗結(jié)核藥物是治愈MDR-TB的關(guān)鍵，目前只有貝達(dá)喹啉和德拉馬尼兩種藥品用于臨床。乙硫異煙胺(ethionamide，ETH)/丙硫異煙胺(prothionamide，PTH)是在1950年發(fā)現(xiàn)的抗結(jié)核藥物，但是因?yàn)檫@兩種藥品的有效濃度和藥物不良反應(yīng)(消化道反應(yīng)、肝損傷等)相關(guān)，限制了應(yīng)用，一直為二線抗結(jié)核藥品；ETH/PTH對(duì)一線藥物耐藥的MTB仍可敏感，所以隨著對(duì)INH、RFP耐藥的MDR-TB的增多， ETH/PTH主要用于MDR-TB的治療，目前仍是WHO相關(guān)指南推薦為RR-TB/MDR-TB治療的藥品之一[2]。近年來(lái)， ETH/PTH增敏劑的研究也取得了明顯進(jìn)展。筆者就兩種藥品的應(yīng)用史、流行病學(xué)、作用機(jī)制、耐藥及與INH交叉耐藥機(jī)制、增敏劑研究等方面進(jìn)行綜述。

一、ETH/PTH簡(jiǎn)介

ETH和ETH是在20世紀(jì)50年代后期合成，都是異煙酸的衍生物。兩種藥品在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出了抗MTB活性，作用機(jī)制和INH相似，都是抑制分枝菌酸的合成，但抗菌活性較INH活性低，ETH對(duì)MTB野生株的最低抑菌濃度(MIC)為 0.5～2 mg/L； PTH對(duì)MTB的 MIC值在0.125～1.0 mg/L[3]。PTH在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出和ETH相似的抗菌活性，并且患者使用中不良反應(yīng)較ETH少[4]。ETH與PTH結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似，可以視為同一種藥物，在應(yīng)用中兩藥可以相互代替[5-6]，我國(guó)僅生產(chǎn)PTH，屬于二線抗結(jié)核藥品，因?yàn)榭诜奖阈约翱色@得性，PTH目前在我國(guó)的MDR-TB方案中常作為一個(gè)基本的組成部分[6-7]。

二、流行病學(xué)

PTH作為二線抗結(jié)核藥品，在我國(guó)抗結(jié)核藥物治療中的應(yīng)用遠(yuǎn)不如一線抗結(jié)核藥物普遍，但是由于和INH存在部分交叉耐藥性，并且隨著在MDR-TB患者中的應(yīng)用時(shí)間延長(zhǎng)，PTH耐藥株在我國(guó)的流行情況及耐藥特征需要了解。2010年我國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，INH耐藥率為 30.8%，PTH總耐藥率為12.9%(95%CI：9.2%～17.4%)[8]；來(lái)自部分結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)顯示，MDR-TB(包括XDR-TB)中PTH耐藥率為4.5%和6.0%[9-10]；來(lái)自一些結(jié)核病專科醫(yī)院的數(shù)據(jù)顯示 MDR-TB(包括XDR-TB)的PTH的耐藥率為20.0%～24.8%[11-13]，其中筆者的研究(數(shù)據(jù)來(lái)自北京胸科醫(yī)院)顯示PTH的耐藥率隨著MDR-TB到XDR-TB耐藥譜的增寬，PTH耐藥率逐漸增高，在MDR-TB中為11.2%，pre-XDR-TB中為30.1%，XDR-TB中為70.6%[14]。而非洲的MDR-TB患者中對(duì)ETH的耐藥率較高， MDR-TB 臨床分離菌株中 78.6%(11/14)對(duì)ETH耐藥，在泰國(guó)的MDR-TB患者中這一耐藥率為15.0%[15]。對(duì)ETH耐藥的菌株基本上都對(duì)INH耐藥[16-17]。由此可見(jiàn)，在不同地區(qū)對(duì)INH耐藥的菌株(尤其是MDR-TB)同時(shí)對(duì)ETH/PTH耐藥的耐藥率具有差異性， ETH/PTH的應(yīng)用需要結(jié)合所在地區(qū)的耐藥菌株流行情況制訂合理的治療方案。

三、ETH/PTH的抗結(jié)核作用機(jī)制

ETH/PTH的抗結(jié)核作用機(jī)制主要是抑制敏感細(xì)菌分枝菌酸的合成而使細(xì)胞壁破裂[6]。INH、ETH/PTH和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)相似，需要在細(xì)菌體內(nèi)激活而發(fā)揮作用。ETH/PTH由黃素腺嘌呤二核苷酸單加氧酶(EthA，又稱EtaA，由Rv3854c編碼)激活，形成ETH-NAD或者PTH-NAD復(fù)合物，之后和INH作用機(jī)制相似，作用于enoyl-ACP還原酶(InhA，Rv1484編碼)[18]，進(jìn)而降低單不飽和酰基ACP(acyl-ACP)到酰基ACP的合成，干擾脂肪酸合酶Ⅱ(FASⅡ)形成，導(dǎo)致分枝菌酸的生物合成的受阻，導(dǎo)致MTB死亡[18-19]。但是因?yàn)楹虸NH存在部分相同作用通路，導(dǎo)致INH和ETH/PTH存在著部分交叉耐藥。

四、對(duì)ETH/PTH耐藥的機(jī)制

對(duì)ETH/PTH耐藥的機(jī)制，主要包括ETH/PTH前藥激活酶 EthA和EthA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子EthR、藥物的作用靶點(diǎn)enoyl-ACP還原酶InhA編碼基因突變，及其他調(diào)節(jié)藥物激活或者作用的酶類基因的改變，如ndh基因、mshA基因、nudC基因等[18]。下面對(duì)3個(gè)主要的耐藥機(jī)制進(jìn)行說(shuō)明。

(一) ETH/PTH的作用靶點(diǎn)InhA的改變(inhA基因突變)

ETH/PTH的作用靶點(diǎn)enoyl-ACP還原酶InhA基因突變，是ETH/PTH耐藥機(jī)制，也是INH和ETH/PTH交叉耐藥的主要機(jī)制。

1960年有研究者從用過(guò)INH但是沒(méi)有用過(guò)ETH的結(jié)核病患者的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了對(duì)INH和ETH共耐藥的菌株[20]； 1990年隨著分枝桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展，證實(shí)MTB的InhA改變是對(duì)INH和ETH共耐藥性的共同機(jī)制。Banerjee 等[21]在1994年通過(guò)構(gòu)建恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)，牛分枝桿菌(M.biovs)耐藥株及敏感株的基因組DNA文庫(kù)，并通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到野生型M.smegmatis、M.biovs、MTB的方法，發(fā)現(xiàn)inhA基因的開(kāi)放閱讀框(Open reading frames，ORF)突變或者inhA過(guò)度表達(dá)足以引起M.smegmatis、M.biovs、MTB對(duì)INH和ETH 共耐藥，同時(shí)通過(guò)基因測(cè)序分析等方法證實(shí)inhAORF的S94A突變是引起INH和ETH共耐藥的原因。把對(duì)INH和ETH耐藥的M.smegmatis中的inhAS94A突變體轉(zhuǎn)染到野生型MTB中，獲得的菌株對(duì)INH和ETH耐藥性較野生型MTB高5倍[22]。分子化學(xué)研究顯示，inhAS94A突變導(dǎo)致InhA共作用因子NADH的米氏常數(shù)(Km值)增加，同時(shí)減少了INH-NAD和InhA(S94A)的結(jié)合，顯著減弱INH-NAD對(duì)InhA(S94A)的抑制作用[23]。另外，inhA調(diào)控序列的c-15t突變，使inhA基因的mRNA水平增加20倍，導(dǎo)致inhA過(guò)度表達(dá)，INH和ETH的對(duì)MTB的MIC增加了8倍[23]。

在對(duì)ETH/PTH耐藥的臨床分離株中，inhA基因突變是比較常見(jiàn)的分子機(jī)制，包括調(diào)控序列和ORF突變。在對(duì)INH和ETH/PTH耐藥的菌株中分別有8%～43%和47%～65%菌株存在inhA基因突變[24]，以調(diào)控序列突變?yōu)橹鳌Ｗ畛Ｒ?jiàn)的突變是c-15t[11,16]，對(duì)INH和ETH/PTH共耐藥的菌株中約70%有此突變，其次是g-17t[16]。單inhAc-15t 突變的MTB臨床株多為對(duì)INH低度耐藥(MIC<2 mg/L)[22]，少部分菌株的MIC略高(MIC在2～4 mg/L)[16]；而對(duì)ETH耐藥的程度變化較大(MIC從<2.5 mg/L 到≥200 mg/L)[16]。而據(jù)報(bào)道在c-15t突變的對(duì)INH耐藥的菌株中有1/2以上合并KatG和ethA、inhA編碼區(qū)突變[16,22]。 對(duì)INH和ETH/PTH耐藥菌株的臨床檢測(cè)結(jié)果中，inhA的ORF突變發(fā)生率較調(diào)控序列低，主要突變類型為S94A，其次是I21T、 I95P[22]，這些突變菌株多對(duì)INH呈低度耐藥[22,25]，對(duì)ETH呈高度耐藥[16]。我國(guó)Tan等[26]的研究顯示，在46株對(duì)PTH耐藥的菌株中，26.1%菌株存在c-15t突變，13%菌株存在S94A突變。而據(jù)報(bào)道在inhA的c-15t突變的對(duì)INH耐藥的菌株中有1/2以上合并katG和ethA、inhA編碼區(qū)突變[22,27]。這可能是由于對(duì)INH和ETH/PTH共耐藥的菌株多為MDR-TB菌株，隨著耐藥種類及程度的累積增加，突變基因及位點(diǎn)也積累增多，對(duì)INH及ETH的表型耐藥也可能是不同機(jī)制的多個(gè)基因位點(diǎn)聯(lián)合突變的結(jié)果；而且對(duì)于沒(méi)有檢測(cè)出inhA基因突變的臨床株，選擇ETH/PTH組成方案時(shí)，也要考慮其他耐藥基因突變存在可能，注意觀察療效及進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)隨訪。

另外，和臨床株的耐藥分子機(jī)制不同，體外含INH和ETH培養(yǎng)基上獲得的耐藥株缺乏inhA基因突變[27]。既往臨床株研究多數(shù)關(guān)注的是對(duì)INH或者ETH/PTH耐藥的菌株(以MDR-TB為主)中inhA的突變情況，對(duì)敏感株中inhA突變情況研究較少。最近幾年來(lái)數(shù)個(gè)臨床研究報(bào)道，inhAc-15t(合并或不合并其他inhAORF基因突變)突變的臨床菌株中仍有一定比例(13.5%～69%)的菌株對(duì)ETH/PTH敏感[11,28-31]。所以筆者認(rèn)為，inhA基因突變與 ETH/PTH表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為耐藥的相關(guān)性可能具有地域性，inhA突變株可能存在其他機(jī)制發(fā)揮對(duì)ETH作用，inhA突變的臨床意義需要進(jìn)一步研究。

(二) ETH/PTH激活酶EthA的改變(ethA 突變)

ETH/PTH需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌的EthA酶激活才能發(fā)揮生物效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)室由ETH藥培養(yǎng)基篩選出耐藥株，有19.4%(7/46)菌株存在ethA基因錯(cuò)義或缺失突變[29]。在臨床株研究中，ethA基因突變也是對(duì)ETH耐藥的一種重要分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道，在對(duì)ETH耐藥的MDR-TB臨床株中有54.2%～100.0%菌株存在ethA突變[15,17,32]，部分菌株合并inhA基因突變。基因ethA的突變中大約2/3的核苷酸變化是錯(cuò)義突變，而其余則是插入、缺失或無(wú)意義突變；這些突變位點(diǎn)分布在ethA的整個(gè)編碼區(qū)域，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn)[18]。我國(guó)Tan等[26]的研究中，46株對(duì)PTH臨床耐藥的菌株中，19株(51.4%) 有ethA突變，16 株(43.2%)有inhA調(diào)控序列突變，6 株(16.2%) 為inhAORF突變。法國(guó)一項(xiàng)研究顯示，對(duì)ETH耐藥的菌株中，62%菌株具有inhA的突變(ORF和/或調(diào)控序列)，47%的ethA存在突變[32]。不同地區(qū)菌株ethA的突變率有差異，結(jié)合體外研究數(shù)據(jù)，考慮ethA基因突變和ETH藥物應(yīng)用，是造成對(duì)ETH耐藥的重要機(jī)制，對(duì)于ETH應(yīng)用較廣泛或者耐藥率較高的地區(qū)，在考慮選擇ETH組成方案時(shí)，有必要進(jìn)行ethA基因的分子耐藥檢測(cè)。

(三) EthA調(diào)控因子EthR的改變(ethR基因)

EthR(Rv3855)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，負(fù)向調(diào)控ethA的轉(zhuǎn)錄。ethR失活的菌株對(duì)ETH高度敏感，ethR過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致MTB對(duì)ETH的耐藥性增加[33]。對(duì)ETH高耐藥的臨床株中，4%的菌株有此突變，突變類型為A95T和F110L[32]；但是部分對(duì)ETH耐藥的菌株含有ethA或inhA突變。基因ethR可能在臨床菌株對(duì)ETH耐藥只中扮演次要的角色。但是，以ethR為靶點(diǎn)抑制劑的研究是新藥研究的一個(gè)方向，目的是減少EthR對(duì)EthA的負(fù)向調(diào)控作用， 促進(jìn)常規(guī)劑量下ETH/PTH的殺菌作用。

五、 ETH增敏劑的研究進(jìn)展

細(xì)胞壁的完整性、通透性、致病性對(duì)于分枝桿菌的生存至關(guān)重要，是一個(gè)重要的藥物靶點(diǎn)。抗結(jié)核藥品ETH/PTH、INH作用于MTB的細(xì)胞壁的脂類的合成過(guò)程，對(duì)這些已經(jīng)存在抗結(jié)核藥物作用機(jī)制的深入了解，進(jìn)一步促進(jìn)了未來(lái)藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及新型藥物的研發(fā)。近年來(lái)基于EthA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子EthR的抑制劑(ETH增敏劑)研究取得了新的進(jìn)展。

ETH作為一種前藥，需要細(xì)菌的單加氧酶 EthA激活才能具有殺菌活性。EthR是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TetR家族的一員，基因ethR與ethA排列在一個(gè)共同的基因間啟動(dòng)子區(qū)域的不同操作子中，負(fù)向調(diào)控ethA的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)抑制EthR的功能，增強(qiáng)ethA的表達(dá)，促進(jìn)ETH/PTH 的殺菌活性，是新藥研發(fā)的一個(gè)方向。

近年來(lái)，采用基于結(jié)構(gòu)或者片段的藥物設(shè)計(jì)方法，通過(guò)虛擬篩選新型分子結(jié)構(gòu)物，在尋找EthR 抑制劑方面進(jìn)行了大量的新型分子研究，發(fā)現(xiàn)一些化合物(如BDM31343、BDM41906)能具有抑制EthR的作用。體外及動(dòng)物體內(nèi)研究顯示，這些抑制物和ETH同時(shí)應(yīng)用，可增強(qiáng)ETH對(duì)MTB敏感菌株的殺菌活性[34]；同時(shí)提高了對(duì)INH和RFP耐藥的MDR-TB菌株殺菌作用，但是對(duì)ethA突變耐藥菌株殺菌作用不確定。在對(duì)EthR 抑制劑進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造中發(fā)現(xiàn)的一種新型化合物SMARt-420，這種化合物失去了與EthR結(jié)合的能力，但是它仍然能增強(qiáng)ETH抗結(jié)核作用[35-36]。用SMART-420處理的牛分枝桿菌BCG轉(zhuǎn)錄組的分析，揭示了編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和氧化還原酶(分別命名為EthR2和EthA2)的兩個(gè)隱性基因的強(qiáng)烈誘導(dǎo)， SMART-420的靶點(diǎn)是EthR2，而不是EthR[37]。SMARt-420與EthR2結(jié)合并改變其構(gòu)象，從而阻斷后者在EthA2啟動(dòng)子上游的結(jié)合。基因ethA2和ethR2是一對(duì)ethA和ethR同源基因，EthR2抑制EthA2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而不是EthA。 EthR2和EthR分子結(jié)構(gòu)相似， SMARt-420 通過(guò)抑制EthA2作用，增加對(duì)ETH有激活作用的EthR2的表達(dá)，同時(shí)繞過(guò)ethA、ethR基因突變靶點(diǎn)，所以SMARt-420 和ETH聯(lián)合可以增加敏感株對(duì)ETH敏感性，同時(shí)提高ethA基因突變的耐藥菌株對(duì)ETH的敏感性，其發(fā)揮作用的靶點(diǎn)仍是InhA[36]。SMARt-420作為ETH的增敏劑的出現(xiàn)將在絕大多數(shù)MDR-TB中提高ETH的殺菌活性，即使對(duì)ETH耐藥的ethA突變菌株，也能發(fā)揮殺菌活性。但是其人體安全性及有效性數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

另外，以InhA為靶點(diǎn)的新型藥物研究也有發(fā)現(xiàn)。烯酰-ACP還原酶InhA是參脂肪酸合成的酶，是抗結(jié)核藥物開(kāi)發(fā)的有效靶點(diǎn)之一。大多數(shù)對(duì)INH耐藥的是katG突變，導(dǎo)致INH-NAD復(fù)合物形成障礙，使得INH不能被激活； ETH/PTH發(fā)揮殺菌作用也是同樣需要激活，ethA等突變導(dǎo)致其激活受阻，進(jìn)而不能和InhA結(jié)合發(fā)揮生物活性。但是設(shè)計(jì)直接抑制InhA的化合物就可以繞過(guò)katG基因和inhA基因，直接發(fā)生效應(yīng)[38]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些化合物對(duì)MTB的InhA有明顯的抑制作用。如二苯醚衍生物具有和InhA具有高親和力等特點(diǎn)，但一些二苯醚化合物只在體外具有顯著的療效，沒(méi)有體內(nèi)活性。在InhA抑制劑中，4-羥基-2-吡啶酮(4-hydroxy-2-pyridones)是種具有體外及體內(nèi)顯著抑制InhA活性和較好藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的新化學(xué)物[38]，具有一定的研究和應(yīng)用前景。

六、總結(jié)

ETH/PTH目前仍是WHO耐多藥治療指南和我國(guó)專家共識(shí)推薦的治療MDR-TB的藥品，了解耐藥特征及分子機(jī)制，將指導(dǎo)我們選擇藥物組成合適方案，同時(shí)基于ETH、PTH作用機(jī)制的新藥的研發(fā)，為耐藥結(jié)核病治療及終結(jié)結(jié)核病的目標(biāo)帶來(lái)新的希望。