三種實驗室診斷技術對結核分枝桿菌復合群檢出率及檢測費用的比較研究

劉彬彬 龔道方 陳振華 郭婧瑋 余艷艷 劉豐平 歐陽輝 譚云洪

2018年世界衛生組織發布的全球結核病報告提出，中國結核病診斷方面的問題之一為中國肺結核細菌學檢出率低，僅為31%，遠低于世界平均水平(57%)[1]。目前，市場上不斷涌現出各種結核分枝桿菌復合群的檢測方法并廣泛應用于結核病實驗室診斷領域，從其中選擇一種適合不同實驗室條件、準確且性價比高的檢測方法尤為重要。目前，湖南省每年肺結核患者的病原學陽性檢出率較低，且實驗室診斷技術的普及程度不夠，因此，本課題組采用前瞻性的方法，通過對結核病患者同一份痰標本同時進行液基夾層杯涂片(采用集菌法；簡稱“涂片法”)、L-J固體培養法(簡稱“L-J培養法”)和結核分枝桿菌復合群核酸檢測(采用恒溫擴增法；簡稱“恒溫擴增法”)，比較3種方法對結核分枝桿菌復合群檢出率的差異，為湖南省各家結核病實驗室診斷技術的選擇提供參考依據。

對象和方法

一、研究對象

采用隨機數字表的方法，從湖南省120家結核病定點醫院中抽取3家作為研究現場，分別為瀏陽市人民醫院、醴陵市湘東醫院、桃江縣人民醫院。以3家醫院2018年11月1日至12月31日就診的肺結核可疑癥狀者(咳嗽、咳痰2周及以上或痰中帶血)為研究對象，根據臨床癥狀、胸部X線攝片及實驗室檢查項目結果，并依據《WS 288—2017 肺結核診斷》[2]的標準對肺結核患者進行診斷。3家醫院入選患者共636例，剔除未留取標本的患者，最終628例患者納入本研究。其中，男463例(73.7%)，女165例(26.3%)；年齡6～94歲，平均年齡(59.4±15.2)歲。

二、研究方法與內容

采用配對設計的方法，即一份痰標本同時進行涂片法、L-J培養法和恒溫擴增法進行檢測，再進行比較，具體方法如下。

1.標本留取及L-J固體培養：每例患者用痰液收集瓶收集3～5 ml痰標本(可多次留)，首先采用4%的氫氧化鈉溶液對痰標本進行充分液化，靜置15 min后用無菌滴管取0.1 ml接種到酸性羅氏培養基上(接種2管)，同時將剩余的液化標本送至分子生物檢測室。每周觀察1次培養基，發現菌落生長后，將陽性菌株送至湖南省參比實驗室，由專門的工作人員挑取菌落完成涂片，菌落經抗酸染色鏡檢呈陽性者報告培養陽性；2個月未見菌落生長報告培養陰性。同一例患者的2管接種標本中，任何一管發現抗酸桿菌生長即判定為L-J培養陽性。

2. 恒溫擴增法：吸取培養后剩余的充分液化的痰標本1 ml加入帶旋蓋的離心管中(同時將剩余的液化痰標本送至液基涂片室)，以離心半徑40 cm，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。再加入生理鹽水1 ml，混勻，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃ 加熱10 min，加熱后迅速冷卻(置于-20 ℃冰箱)10 min，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心2 min，將上清液加入含有混勻試劑的PCR管中，蓋好管蓋，以離心半徑40 cm，10 000 r/min 離心5 s，立即進行擴增反應；反應程序：63 ℃，反應時間45 min(恒溫擴增熒光檢測儀型號：Deaou-308C)。結果判讀標準為：若擴增曲線呈“S”型，檢測結果為陽性，即含有結核分枝桿菌復合群；如果擴增曲線不呈“S”型，是一條直線或傾斜的直線，檢測結果為陰性，即不含結核分枝桿菌復合群。

3. 涂片法：將剩余的所有充分液化的痰標本轉入液基夾層杯(液基夾層杯由湖南天騎生物科技有限公司生產)中，再加入適量的液基專用消化液(不能超過20 ml)，將夾層杯置于干片機中60 ℃滅活10 min，再將其置于離心機中，以離心半徑20 cm，4500 r/min離心5 min，脫蓋輕緩棄去所有上清液，置干片機中60 ℃干片8 min，滴加染液A完全覆蓋住基膜，置于干片機中60 ℃熱染5 min，棄掉A液，用水緩慢沿杯壁沖洗2遍，滴加B液5～10滴，脫色90 s，用水緩慢沖洗2遍，脫色2次直至殘余的A液脫完，滴加C液5～10滴復染1～5 min，棄去C液，緩水沖洗2次，用取片針將夾層杯內底膜頂出，用鑷子夾出基片，靠近杯底的一面朝上，用吸水紙吸干表面水分。滴一滴中性膠于玻片，菌膜朝下封片。滴加鏡油，使用顯微鏡100倍油鏡閱片。

4.陽性菌株的菌種鑒定：將運送到湖南省結核病參比實驗室的陽性菌株進行涂片染色，挑取抗酸染色結果為陽性的適量菌落至裝有生理鹽水和玻璃珠的磨菌瓶中，振蕩混勻成菌液，靜置15 min 后，用無菌滴管吸取0.1 ml到對硝基苯甲酸(PNB)上，置溫箱培養1個月后觀察結果。若PNB培養基上有菌落生長，提示為非結核分枝桿菌；若無菌落生長，提示為結核分枝桿菌復合群。同時吸取0.1 ml滴到MPB64抗原檢測板上，15 min后觀察結果，檢測板只有1條紅色的線為陰性，即提示非結核分枝桿菌或者少量MPB64抗原陰性的結核分枝桿菌復合群；出現2條紅色的線為陽性，即提示結核分枝桿菌復合群。最后，將PNB陽性、MPB64陰性，PNB陰性、MPB64陰性，PNB陽性、MPB64陽性的菌株分別提取DNA，將DNA送至北京睿博興科生物技術有限公司進行測序，最終確定是否為非結核分枝桿菌。

5.評價指標：對比分析3種檢測方法對結核分枝桿菌復合群陽性檢出率的差異；并以臨床診斷為參考標準，計算各種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率，以及以患者進行每項檢測的實際支出費用為準，計算每種方法的檢測費用。

計算公式：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致率=(兩種方法檢測均為陽性例數+兩種方法檢測均為陰性例數)/檢測總例數×100%。

3種方法發現病原學陽性患者的平均檢測費用：每種方法的檢測費用均按市場價計算，即按患者進行上述檢測實際支出的費用計算。液基夾層杯涂片的市場價為120元/例；L-J固體培養的市場價為50元/例；結核分枝桿菌核酸檢測(恒溫擴增法)的市場價為260元/例。

三、質量控制

項目研究現場的選擇嚴格按照隨機抽樣方法抽取，以最大程度地反映湖南省的情況；所有參加此項目的工作人員均進行過嚴格系統的項目啟動培訓，掌握實施方案，項目實施過程中嚴格按照實施方案標準進行患者納入、表格登記、實驗操作、結果判斷等，并同時每天做好相關儀器設備的維護保養；實驗操作過程中每批測試均做陰性、陽性質控標本的測試。

四、統計學分析

采用Excel 2007軟件對數據進行整理，并通過雙人核實。采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。3種方法兩兩之間結核分枝桿菌復合群檢出率的比較采用配對四格表的卡方檢驗，檢驗水準α=0.05/3=0.017；3種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率的比較，采用計算率的95%的置信區間進行比較。

結 果

一、臨床診斷結果

628例可疑肺結核患者中，臨床最終診斷為肺結核患者153例(24.4%)；非肺結核患者475例(75.6%)，包括非結核分枝桿菌肺病6例。其中NTM肺病患者先經過PCR檢測確定為NTM，再取患者培養陽性菌株提取DNA送至測序公司進行測序，最終診斷為NTM肺病。

二、3種方法陽性檢出率和結核分枝桿菌復合群陽性檢出率情況

在肺結核可疑癥狀者中，L-J培養法、涂片法和恒溫擴增法的陽性檢出率分別為14.8%(93/628)、13.9%(87/628)和12.3%(77/628)。培養共接種1256管，有32管污染(64管)，污染率為5.1%；剔除6例NTM肺病患者后，涂片法、L-J培養法和恒溫擴增法的結核分枝桿菌復合群陽性檢出率分別為13.5%(84/622)、14.0%(87/622)和12.2%(76/622)。采用配對設計的卡方檢驗(剔除6例NTM肺病患者和32例培養污染的患者)，結果顯示：每兩種方法結核分枝桿菌復合群陽性檢出率之間差異均無統計學意義，見表1～3。以臨床診斷為參考標準計算3種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率及其95%置信區間，三者之間差異均無統計學意義。見表4。

表1 涂片法與L-J培養法的配對四格表

表2 L-J培養法與恒溫擴增法的配對四格表

表3 涂片法與恒溫擴增法的配對四格表

表4 以臨床診斷為參考標準判斷3種方法檢測的診斷效能

表5 3種方法的平均檢測費用

三、3種方法的平均檢測費用

3種方法發現1例病原學陽性患者的平均檢測費用從高到低依次為恒溫擴增法、涂片法、L-J培養法。見表5。

討 論

最新版的肺結核診斷指南——《WS 288—2017肺結核診斷》[2]中將結核病分子生物學檢測納入了結核病病原學檢查范疇，這將對各種結核病分子生物學檢測方法提出更高的要求；傳統的直接涂片法簡單快捷、成本低、易普及，目前仍是國內最普遍使用的結核病實驗室檢測手段[3]，但是其陽性檢出率低，難以滿足臨床診斷需求，因此本研究采用涂片法、L-J培養法和恒溫擴增法同時檢測疑似肺結核患者的痰標本，判斷3種不同檢測方法陽性檢出率的差異。

本研究結果顯示，3種檢測方法對結核分枝桿菌復合群陽性檢出率的差異無統計學意義；以臨床診斷結果為參考標準，3種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值差異均無統計學意義。代小偉等[4]、宋紅煥等[5]和馬曉光等[6]的研究結果均顯示分子生物學方法的陽性檢出率高于傳統涂片法，這與本研究的結果不完全一致。原因可能是：(1)不同研究的試驗設計方法不完全相同，本研究采用的是配對設計的前瞻性研究，而部分研究則采用成組設計的回顧性研究，一般成組設計的回顧性研究存在較大的偏倚，在方法之間進行結果的比較時，配對設計比成組設計的數據更有說服力；(2)所選用的分子生物學方法不完全相同，目前上市的結核病分子生物學檢測方法種類很多，不同試劑盒的檢測靶標、引物設計、擴增方式和條件均不完全相同；(3)本研究采用的涂片法是液基夾層杯涂片技術，其雖也屬于涂片技術，但不同于傳統的涂片方法，其采用的是“集菌法”，通過離心過濾將液化后的所有痰液全部積聚在一張膜上，再經過抗酸染色鏡下觀察，其最低檢出限值沒有數據可查，而培養的最低檢出限值大約為100菌落形成單位(CFU)/ml[7]，分子生物學檢測方法的最低檢出限值為10～104CFU/ml[8]，簡單涂片法的最低檢出限值為103～104CFU/ml[9]，從方法原理上就能推測液基夾層杯的最低檢出限是高于傳統涂片法的。并且平均發現1例病原學陽性患者的檢測費用由低到高依次為L-J固體培養、涂片法、恒溫擴增法。這提示實驗室在這三類診斷技術方法之間做選擇時，在首要考慮各方法陽性檢出率的基礎上，需綜合考慮各種方法的優勢和局限性：液基夾層杯涂片技術操作簡單，工作人員依存性高，普及程度較高，可當天出具報告，但是只能鑒定到“是否為抗酸桿菌”的水平；L-J固體培養檢測費用低，操作相對簡單，且可獲得活菌進行藥物敏感性試驗，但是結核分枝桿菌生長緩慢，耗時長，需5～8周時間，明顯滯后于臨床對肺結核早期診斷的期望[10]；核酸檢測生物安全程度高，可當天出具報告，結果可鑒定到“是否為結核分枝桿菌復合群”的水平，但是對實驗室條件要求較高并且檢測費用較高。

因此，實驗室在進行診斷技術的選擇時，應該綜合考慮當前實驗室條件、試劑成本、時效性、操作依從性和結果準確性等因素，選擇最適合當地的結核病診斷技術。如果在經濟差的地區，尤其在基層地區，建議傾向選擇使用液基夾層杯涂片和L-J固體培養；若在經濟條件好、實驗室條件允許的地區，可根據情況同時使用液基夾層杯涂片、L-J固體培養和結核分枝桿菌核酸檢測，從而保證更快、更準確地獲得檢測報告。