牛樟芝三萜類化合物的提取工藝及其檢測方法研究進展

吳昊，郭美娟，王紅，張巖，劉曉光，張蘭天

（河北省食品檢驗研究院河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊050091）

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、牛樟菇、紅樟芝、樟窟內菇，通常腐生于牛樟樹上百年的樹干空洞內，而牛樟樹主要在海拔600 m～1 000 m以上地區分布，故牛樟芝是一種非常珍稀的藥用菌[1]。牛樟芝子實體的形態特征非常多樣，其子實體的表面多為紅棕色、淺棕色或淺黃棕色。研究表明牛樟芝具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節及保肝等作用[2-7]，也可用于治療食物和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和皮膚瘙癢等[8]，其主要活性成分有三萜類化合物、多糖、馬來酸和琥珀酸的衍生物、脂肪酸、泛醌類化合物等[9]，其中，三萜類化合物是目前牛樟芝子實體中發現最多的萜類化學成分，被認為是牛樟芝萃取物中苦味成分的主要來源。

目前專家學者從牛樟芝子實體及菌絲體中陸續分離得到的三萜類化合物多達40余種，其中僅牛樟芝所特有的三萜類化合物便有10多種[10-11]。牛樟芝三萜類化合物在抗腫瘤活性調節中扮演著重要角色，其具有抑制肝癌細胞的增殖、毒殺老鼠血癌細胞活性、抗血清素活性、活化神經細胞生長能力等功能[12]。試驗證實，從牛樟芝子實體中提取的麥角甾烷型三萜類化合物對人類肝癌細胞、肺癌細胞以及乳腺癌細胞的細胞毒性均表現顯著，并且對人類結腸癌細胞有著明顯的協同毒害作用[13]。在鏈脲佐菌素誘導的高血糖糖尿病小鼠模型中，牛樟芝三萜類化合物能夠減輕炎癥反應，促進傷口愈合[14]。此外，三萜類化合物還對血管緊張素轉換酶的活性有著顯著的抑制作用，可以降低血壓，防止高血壓患者因血壓過高導致腦血管破裂而中風[15]。

本文對牛樟芝三萜類化合物的提取工藝及其檢測方法的研究進展進行綜述，以期為牛樟芝三萜類藥食同源產品的深入研究以及開發利用提供思路和理論參考。

1 牛樟芝三萜類化合物的提取方法

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是根據牛樟芝子實體和菌絲體中的各組分在溶劑中的溶解性質不同，選用對三萜類化合物溶解能力強，對其它組分溶解能力弱的溶劑，從而將三萜類化合物提取出來的方法。目前常用乙醇、甲醇或異丙醇溶液作為溶劑，對牛樟芝發酵液和菌絲體進行室溫浸提、煎煮或加熱回流提取，從而獲得總三萜提取物。

1.1.1 室溫浸提

作為較傳統的提取方法，當前室溫浸提法仍是獲得牛樟芝總三萜的主要工藝手段。劉燕隔[16]在室溫（20℃左右）下采用醇提法來制備牛樟芝菌絲體中三萜類化合物，將牛樟芝菌絲體粉末在75%乙醇、提取溫度80℃、分離純化時間1.5 h、料液比1∶40（g/mL）的條件下進行分離純化，之后于4 000 r/min離心10 min，取上清液，便得到提取液。同時，諸多專家學者在優化室溫浸提法提取工藝方面也展開了相關研究。韓金龍[17]選取95%甲醇、乙醇和異丙醇3種較常用的提取試劑對牛樟芝中的總三萜進行提取，發現乙醇的提取效果略高于甲醇，異丙醇的提取效果最差。黃紅雨等[18]將響應面法應用于對牛樟芝總三萜提取工藝的優化，并根據單因素和響應面試驗得出最佳提取工藝參數為：乙醇濃度78%、提取時間81min、料液比 1∶20（g/mL），在此條件下，牛樟芝總三萜提取率為5.26%。

1.1.2 熱回流循環提取

熱回流循環提取工藝是一種新型動態提取濃縮工藝，集提取濃縮為一體，其使用的裝置是一套全封閉間歇循環動態提取裝置。目前熱回流循環提取法大量使用于規?；墓I生產中，具有生產方式簡單、技術成熟度高、提取量大、生產成本低等優點[19]。王宮等[1]采用正交設計法確定了牛樟芝總三萜最佳回流提取工藝為3倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，之后用氯仿溶解濾液，再用飽和NaHCO3溶液萃取4次，牛樟芝總三萜提取率達到10.02%。

1.1.3 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法已在中草藥提取和成分鑒定中取得一定的成果，超聲波輔助提取三萜類化合物具有提取率高、時間短、提取成分完全、污染少、設備簡單等優點。王光磊等[20]采用L4（23）正交試驗法確定超聲輔助提取法的最佳工藝條件為：樟芒與乙醇料液比1∶15（g/mL），在150 W功率下提取60 min。韓金龍[17]研究發現超聲輔助提取牛樟芝總三萜的最佳工藝為：料液比 1∶100（g/mL），提取劑 95%乙醇，提取溫度50℃，提取時間1 h，超聲功率為300 W。呂莎等[21]通過星點設計-效應面法優化得到牛樟芝總三萜的最佳提取工藝為1∶20（g/mL）液料比用倍的90%乙醇超聲輔助提取2次，每次40 min，超聲功率400 W，在此工藝條件下，提取率可達11.87%。

1.1.4 微波輔助提取

作為一種新型提取方法，微波輔助提取法己在黃酮、皂苷、多糖、三萜等有效成分的提取中廣泛應用。韓金龍[17]以95%的乙醇為提取溶劑，對比冷浸24 h，熱回流6 h，超聲1 h和微波10 min 4種不同方法，發現在較短的時間內微波輔助提取法的提取效果最優，并且以增加三萜提取量為目的確定了該法的最佳工藝為：萃取劑二氯甲烷、提取劑90%乙醇，料液比1∶51（g/mL），時間 9.5 min，溫度 65℃，功率600 W，在此工藝下三萜提取量可達到7.65 mg/g。但微波輔助提取法的處理量很小，從而限制了其在工業生產中的規?；瘧?。

1.2 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是一種新型提取分離方法，在近常溫條件下便可實現對不同極性、不同沸點化合物的提取分離，在提取分離過程中，原料的有效成分幾乎可以被全部保留，同時無有機溶劑殘留。該法操作簡單并且節約能源，通過超臨界流體萃取法獲得的產物純度和提取率均較高。近幾年，該法發展較快，在萜類物質提取方面的應用日漸增多，馬禮金等[22]曾用超臨界流體對紅芝及其孢子中的三萜類化合物進行提取。但超臨界提取所需設備價格昂貴，成本較高。

2 牛樟芝三萜類化合物的檢測

牛樟芝三萜類化合物的檢測分析方法現在已經基本成熟，主要有重量法、比色法和色譜法。此外，通過充分利用新技術，專家學者還在不斷建立新型的快速檢測方法，如Rao等建立的高效液相色譜-二極管陣列檢測法，該方法能夠同時測定牛樟芝中10種三萜類化合物成分，能夠成功實現對牛樟芝子實體和菌絲體中三萜類化合物的定性和定量分析[23]。

2.1 牛樟芝總三萜的檢測

2.1.1 重量法

根據三萜類化合物的極性，采用水和氯仿（或乙酸乙酯、正丁醇）對牛樟芝進行分離萃取，有機相分離濃縮后得到的物質即為總三萜，采用此法對總三萜進行測定即為重量法[24]。重量法較為簡便，應用較為廣泛，但是由該法所得總三萜的純度不高。

2.1.2 比色法

牛樟芝中總三萜的檢測一般采用分光光度法，該方法具有靈敏度高、準確度好、結果穩定、重現性佳的優點。目前應用較為廣泛的比色法主要是香草醛-高氯酸法[25-26]，即利用三萜類化合物在加熱條件下可與香草酸和高氯酸發生顯色反應，將三萜類化合物在550 nm下的吸光度按照齊墩果酸標準液制作出的標準曲線進行計算，可以確定牛樟芝中總三萜的含量[27]。此外，也有相關研究是依據熊果酸標準液制作出的標準曲線來測定牛樟芝總三萜含量[18]。除了香草醛-高氯酸法，有研究采用硫酸乙醇顯色法來測定提取液中三萜類化合物的含量，但樣品中的干擾物質對這兩種方法都有較大影響。

2.2 牛樟芝三萜類單體成分的檢測

目前用于牛樟芝三萜類單體成分的分析檢測方法主要有光譜學、生物學及色譜學方法，其中，以色譜學方法應用最為廣泛。用于牛樟芝三萜類單體成分檢測的色譜法主要包括薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法及其與質譜聯用等方法。

2.2.1 薄層色譜法

薄層色譜法屬于吸附色譜法，該法兼備了柱色譜和紙色譜的優點，是一種微量、快速、簡單、分離能力強的方法，近年來已被成功應用于定量分析三萜類單體成分。但是薄層色譜法在三萜類化合物的測定方面仍存在一定的缺陷，如該法不適用于總三萜含量分析，同時其分析準確性、重現性和選擇性較差，因此一般只能采用該法做半定量或限度試驗。張寅等[28]運用薄層色譜-分光光度法排除脂肪等物質的干擾對牛樟芝菌粉中的總三萜含量進行了檢測。韓金龍[17]將牛樟芝總三萜粗提物經分離純化后進行薄層色譜分析，并以齊墩果酸為標準品，得到的薄層色譜與標準品的位置和顏色均接近。Chen等[29]利用薄層色譜對不同生長階段的紅色和白色牛樟芝中的三萜類物質進行分析，發現不同菌種、不同生長階段其三萜類物質存在差異。

2.2.2 氣相色譜法

氣相色譜法具有靈敏度高、準確度高、重現性好等優點，但該法要求化合物具有一定的揮發性，而大多三萜類物質的揮發性較差，因此采用該法進行定量分析時往往需要將三萜類物質進行衍生化處理后才能進行檢測，這使得該法的應用在一定程度上受到了限制。

2.2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法常被用于三萜類物質的定性定量分析，該法具有分析范圍廣、速度快、分離效能高、分析高效、高分辨率、高靈敏度等優點[30]。但是該法一般是以極少數的幾種三萜為標準品，相應地測定原料中某幾種三萜的含量，而對于總三萜含量的測定仍存在困難。將牛樟芝總三萜粗提物經酸堿沉降和萃取洗滌分離純化后，在最佳流動相為甲醇∶水=90∶10（體積比）的條件下進行高效液相色譜分析，可以得到與標準品相對應的相對保留時間和峰面積[17]。

2.2.4 液質聯用色譜法

液質聯用色譜法具有低耗樣量、低流速、分析范圍廣、線性范圍寬、靈敏度高、特異性強、分析時間短等其他方法所不可比擬的優勢，這些優勢可以克服分析中三萜類化合物成分復雜、基質抑制效應顯著、吸收性強的困難。徐萌萌[31]采用超高效液相色譜-質譜聯用法對牛樟芝胞內三萜類化合物進行分離鑒定，共鑒定出6種羊毛甾烷類物質，依次為3β，15α-二羥基羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸、3β，15α-二羥基羊毛甾-8，24（28）-二烯-21-酸、去氫硫色多孔菌酸、去氫齒孔酮酸、齒孔酸，這些物質均具有很好的生物活性。

2.2.5 近紅外光譜法

近紅外光譜法是一種新型的綠色分析方法，具有準確、快速及非侵入式分析等優點，該法已廣泛應用于食品和藥品的定性及定量分析。近紅外光譜是電磁輻射波的一種，波長范圍是780 nm～2 500 nm，與分子中C-H、O-H、N-H和S-H基團振動的合頻以及各級振頻相關。以齊墩果酸為標準品進行近紅外光譜分析，與標準譜圖對比，特征峰基本一致，將分離純化后的牛樟芝三萜物質進行近紅外光譜分析，得到譜圖中的特征峰與標準譜圖的基本一致[17]。初秋博等[32]應用近紅外光譜結合化學計量學方法建立牛樟芝菌絲體樣品中多糖和三萜組分的定量分析模型，能夠快速、準確和無損地對牛樟芝及其誘變菌株的菌絲體樣品的有效成分進行定量分析。

3 結語

近年來，牛樟芝得到了諸多關注，同時國內外的專家學者也對牛樟芝中三萜類化合物的結構成分、提取方式及檢測方法進行了廣泛、深入研究。隨著技術的飛速發展，牛樟芝中三萜類化合物的提取工藝和檢測方法都在不斷改進，只有充分利用新工藝新技術新方法才能使牛樟芝三萜類化合物的研究更加便捷、深入地開展，才能真正實現對牛樟芝三萜類藥食同源產品的研究開發。