非編碼RNA與缺血性腦卒中后血管新生的研究進展

黃麗丹，陶華，陳潤森，許向明 綜述 鐘望濤，崔理立 審校

廣東醫科大學附屬醫院神經內科，廣東 湛江 524000

目前，治療缺血性腦卒中最有效的方法是靜脈溶栓，但是也僅有不超過1/3的患者通過血管再通，病情得到改善。鑒于多數患者預后不良，臨床迫切需要更有效的治療手段。已有研究表明，當大腦的供血動脈嚴重狹窄或閉塞時，血流通過新生血管側支循環的方式，改善受損腦組織中的缺血缺氧狀態，有助于神經功能的恢復[1]。也有研究證明腦缺血部位毛細血管密度較高的患者預后較好，死亡率亦較低[2]。因此，改善缺血區域的血管新生能力被認為是缺血性腦卒中的有效治療方法之一[3]。

1 非編碼RNA在血管新生調控中的特殊性

已有研究發現，許多血管生成因子和信號傳導途徑參與調節血管生長和形態發生[4]，例如血管內皮生長因子(VEGF)，是促血管生成的關鍵調控分子。在龐大的人類基因組中，編碼蛋白質的DNA片段所占比例不超過2%，其余約98%的DNA 序列無蛋白質編碼功能。后者的轉錄產物被稱為非編碼RNA(ncRNAs)，這提示ncRNAs 在血管生成過程中，可能較蛋白編碼分子發揮更為廣泛的調控作用。

事實上，ncRNAs 可根據長度劃分為兩類：小ncRNAs (＜200 bp，包 括piRNA、siRNA 和miRNA、snoRNA 等)和長ncRNA(lncRNA，＞200 bp)[5]。近年來，大量研究證實ncRNAs 在血管生成過程中的功能[6-8]，并且參與缺血性腦卒中后的病理恢復過程[9-10]，這提示它們可能是值得關注的潛在調控分子。

2 非編碼RNA在腦梗死后血管新生中的研究

2.1 miRNA 與腦梗死后的血管新生 微小RNA(miRNA)是一類保守的非編碼小RNA，通過靶向結合mRNA 的3'-非翻譯區(3'UTR)，在轉錄后水平調控靶基因的表達。作為轉錄后基因沉默的重要介導，miRNA 在缺血性中風的病理過程中起著重要作用。JIN 等[11]通過檢測急性腦梗死患者和健康對照者血漿中5 種血管生成相關miRNA (miR-126、miR-130a、miR-222、miR-218 和miR-185)的 表達 水平，發 現miR-126 和miR-130a 的表達水平與AIS 患者的疾病風險、嚴重程度和炎性細胞因子的表達水平相關。

2.1.1 miR-126 和miR-210 有學者認為，miR-126是內皮細胞中最豐富的miRNA，在血管生成中起著至關重要的作用[12]。PAN等[13]觀察到miR-126過表達通過激活PI3K/AKT/eNOS 途徑增加內皮祖細胞(EPC)的NO 產生，促進EPC 的增殖、遷移和管形成能力；轉染miR-126的EPC顯著減少MCAO小鼠的梗死體積和神經功能缺損評分，并可見腦微血管密度增加、腦血流量的改善和血管生成現象。也有研究發現，miRNA-126-3p和miR-126-5p的過表達通過下調PTPN9 和激活AKT/ERK 信號通路，促進人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移和管形成，改善缺血性小鼠腦梗死體積，促進腦缺血后血管重塑，并進一步改善神經行為恢復[14]。相反地，在體外和動物模型中，miRNA-126受EGFL7干擾后，可導致PI3K/AKT信號通路下調，并抑制HUVEC的管形成[15]。據報道，缺氧誘導的miR-210 是缺氧反應中血管生成和內皮細胞存活的關鍵調節劑，因其在低氧誘導條件下均一致表達上調而被認為是低氧標志性miRNA。miR-210 過表達可通過調控其靶蛋白BDNF 的表達水平，促進缺血性小鼠腦的血管生成和神經發生，進而改善長期神經行為結果[12]。有研究以環肽偶聯外泌體(RGD-exo)作為遞送系統，將miR-210 遞送至MCAO 小鼠腦部，缺血區域VEGF表達增加，誘導局灶性血管生成，從而提高MCAO小鼠存活率[16]。

2.1.2 miR-26a、miR-195 和miR-150 如前 所述，VEGF 是促血管生成的關鍵調控分子，miRNA 通過直接或間接作用于VEGF 及其相關信號通路，調控血管生成的過程[7]。有研究發現miR-26a 通過激活AKT 和ERK1/2 途 徑 上 調HIF-1a 的表達，從而介導VEGF 的轉錄活性，促進腦微血管內皮細胞(BMECs)中細胞增殖和血管生成[17]。與此相反，miR-195 通過下調其靶基因VEGFA 的表達水平，從而抑制內皮細胞侵襲能力和管形成[18]。相似地，miR-150 過表達特異性地抑制VEGF的表達，從而降低MCAO大鼠梗死區周圍腦組織的血管密度，抑制BMVECs 的血管生成、增殖和遷移[19]。

2.1.3 miR-140-5p 和miR-377 鑒于部分miRNA 對血管生成具有抑制作用，有多個研究證實可通過敲低或抑制靶miRNA，以促進血管生成的基因表達和增加腦微血管形成。SUN 等[20]研究表明，抑制miR-140-5p 可以增加其靶基因VEGFA 的表達，從而增強HUVECs的增殖、侵襲、管形成。另有研究報道，抑制miR-377可調節EGR2的抗炎作用和VEGF的血管生成作用，促進了BMECs細胞增殖、遷移和毛細血管形成，并通過抑制MCAO大鼠的腦炎癥和促進血管生成來減輕缺血性腦損傷[21]。

2.1.4 miR-124、miR-137 和miR-191 等 除了VEGF，miRNA 亦可通過其他血管生成因子及信號通路，調控血管新生過程。DOEPPNER等[22]證明鋰通過增加miR-124 表達，降低RE1 沉默轉錄因子豐度，從而促進缺血后神經重塑和血管生成，進而改善腦卒中小鼠神經功能缺損及長期預后。也有研究表明，miR-137在MCAO小鼠中通過Notch信號通路靶向調控NR4A2，增加內皮祖細胞增殖和血管生成[23]，而miR-191 則直接調節血管內皮鋅指1 (VEZF1)，導致VEZF1下游的各種血管生成因子發生變化，進而抑制缺血性腦損傷后血管生成[24]。此外，下調miRNA-27b通過誘導AMPK 的活化，增加了BMEC 管形成和遷移，增強MCAO 小鼠腦缺血邊界區血管生成，進而促進缺血性中風后的恢復[25]，而miR-493 則通過直接靶向MIF 抑制RBMEC 的管形成和遷移，當其表達水平被下調后，缺血腦組織的毛細血管密度增加，梗塞體積減少并可見MCAO 大鼠的神經功能缺損得到明顯改善[26]。

2.2 lncRNA 與腦梗死后的血管新生 LncRNA被定義為超過200 個核苷酸，沒有編碼蛋白質功能的RNA，曾被認為是基因組轉錄的噪音。然而，越來越多的研究提示，lncRNA 是血管生成過程中關鍵的調節因子，參與缺血性腦卒中后的血管生成過程[27-28]。

2.2.1 Meg3 Meg3 廣泛表達于腦和內皮細胞。Meg3失活可促進血管生成的基因表達和增加腦微血管形成。研究報道，lncRNA Meg3 在體內和體外均負調節Notch 信號通路，減少缺血性腦組織的血管生成。Meg3 的沉默增加了內皮細胞遷移、增殖和管形成[27]。SHEN 等[29]證明敲 除Meg3 促 使 血 管生成 相 關基因Vegfa 和Vegfr2 上調，增強內皮細胞遷移和管形成，增加缺血腦的毛細血管密度，也可通過調節p53/NOX4 軸增強促HIF-1α和VEGF 表達，促進腦梗死后的血管生成，減少由OGD/R誘導的RBMVECs凋亡[30]。

2.2.2 MALAT1 MALAT1 也稱為核富含豐富的轉錄本2(NEAT2)，是高度保守的lncRNA。在腦缺血后腦微血管內皮細胞中，Malat1是上調程度最高的lncRNA 之一，其參與保護BMECs[31]。有報道認為Malat1在體外和體內均與Bim和E-選擇素結合，在腦微血管系統中發揮抗凋亡和抗炎作用，以減少缺血性腦 損 傷[9]。REN 等[32]進 一 步 發 現，Malat1 通 過 靶 向miR-145 直接上調VEGF-A 和ANGPT2，促進腦微血管內皮細胞血管生成，減少由OGD 誘導的BMECs 凋亡。此外，通過慢病毒載體轉染，可見shMALAT1 降低了15-脂氧合酶1(15-LOX1)、VEGF 的表達以及信號傳導和轉錄激活因子3(pSTAT3)的磷酸化，揭示了MALAT1 可能通過15-LOX1/STAT3 信號通路調節血管生成[33]。

2.2.3 SNHG12 SNHG12 是一種新型的lncRNA，在OGD處理后的BMEC和MCAO小鼠腦中表達均顯著增加。在OGD/R 條件下，SNHG12 作為miR-150的競爭性內源RNA，抑制促炎細胞因子的表達，并促進促血管生成因子VEGFA 和FGFb 的表達，從而改善MCAO 小鼠神經功能的恢復[34]。值得一提的是，MALAT1 在OGD 期間和之后，也可見VEGFA和FGFb mRNA 和蛋白質的表達水平增加，進而促進BMEC血管生成，其對抗缺血性腦損傷的保護作用的潛在機制是通過miR-199a介導的[35]。

2.2.4 其他lncRNAs 除此之外，尚有部分lncRNAs充當miRNA海綿，作用于血管生成因子VEGF及Notch 等通路，參與腦缺血后血管生成的過程。SNGH1在OGD/R條件下，直接靶向吸附miR-199a，促進腦微血管內皮細胞存活和血管生成[36]。HIF1A-AS2則充當miR-153-3p的海綿，促進HIF-1α/VEGFA/Notch1級聯的激活，上調HIF-1α，從而促進缺氧時HUVEC的活力、遷移能力和管形成[37]。NEAT1 通過靶向miR-377，上調VEGFA、SIRT1 和BCL-XL 的表達，從而促進了OGD誘導的BMEC的存活和血管生成[38]。

2.3 cirRNA 與腦梗死后的血管新生 環狀RNA(cirRNA)是一類特殊的非編碼RNA，近年來被證實在生物活動中發揮著重要的調控作用。基于基因芯片的生物信息學分析表明，腦缺血后大量cirRNAs異常表達，提示circRNAs和腦梗死后病理損傷和修復過程密切相關[39-42]。

2.3.1 cirRNA 參與腦梗死恢復過程 既往研究表明，circRNA 通過競爭性內源RNA(ceRNA)機制在疾病中發揮著重要的調控作用。據報道，circTLK1作為ceRNA 抑制miR-335-3p 的活性，導致神經元損傷。敲除circTLK1 可顯著減少MCAO 小鼠腦梗死體積，減輕神經元損傷，并改善隨后的長期神經功能缺損[43]。circDLGAP4 抑 制miR-143 活 性，從 而 導 致HECTD1 表達增加，而circDLGAP4 的過表達顯著減少了MACO 小鼠梗塞面積并改善神經功能缺損[44]。circHectd1在MCAO小鼠腦和AIS患者血液中表達增加，其作為ceRNA抑制miR-142活性，導致TIPARP表達的抑制，進一步將其敲除后，可見tMCAO小鼠的梗死面積顯著減少，神經元損傷減輕[45]。另有人體研究發現，circ Hectd1 的表達與腦梗死發病風險、嚴重程度、炎癥和復發風險呈正相關[46]，這提示其是腦梗死疾病風險和預后的潛在生物標記。

2.3.2 cirRNA 參與血管新生過程 目前，circRNAs參與血管新生過程的機制研究不多，主要集中于腫瘤及病理性血管生成領域，例如通過HIF-1α信號通路參與Moyamoya病的血管生成[47-48]，通過激活VEGF/VEGFA等信號通路促進腫瘤血管生成和發展[49-50]。此外，也有大量研究發現，circRNA參與調節動脈粥樣硬化、糖尿病的HUVECs 增殖、凋亡和血管生成基因的表達[51-53]。

3 臨床轉化的前景與挑戰

如上所述，大量ncRNAs 被證實參與腦梗死后的血管新生過程，但是尚無相關臨床轉化研究，故而這些ncRNAs 是否可以作為腦梗死后的新治療靶點，以及預后的生物標志物尚不清楚。盡管如此，根據現有研究，在開展臨床轉化研究前需要考慮如下因素。

首先，許多microRNA 和lncRNA 在神經元細胞，腦血管內皮細胞，小膠質細胞中差異表達，circRNA是否有同樣的細胞特異性表達方式尚不清楚。其次，microRNA 和lncRNA 的表達因其不同的半衰期而具有時間依賴性，提示其作為中風患者的診斷或預后的生物標志物可能不太可靠，但是circRNA 因具有相對更長的半衰期，而使得它們可能成為用于中風診斷和預后的生物標志物的理想候選者。最后，已有動物研究通過慢病毒載體攜帶相關miRNA經顱入腦，促進血管生成從而改善神經功能缺損，但是這種方法因為安全性無法臨床轉化。因此，如何應對血-腦屏障對ncRNAs的阻滯作用也很關鍵。

總之，盡管面臨各種挑戰，但靶向調控ncRNAs仍然是腦梗死后血管新生的潛在治療策略。隨著對ncRNAs 調控機制的深入研究，相信在不久的將來可找到合適的調控分子，實現臨床轉化，并有機會發展成為腦梗死重要的治療策略。