重組結核分枝桿菌11 kDa蛋白鑒別潛伏性結核感染與卡介苗接種的研究

趙愛華 康萬里 王國治 高正倫 都偉欣 盧錦標 沈小兵 蘇城 徐苗 鄭素華

重組結核分枝桿菌11 kDa(相對分子質量為11 000)蛋白(簡稱“重組11 kDa蛋白”)是選擇卡介苗特異性丟失并與結核毒力相關的ESAT-6基因，經大腸埃希菌表達的結核分枝桿菌特異性的重組蛋白[1]。臨床前研究證實，該變態反應原可有效鑒別結核分枝桿菌感染與卡介苗接種，以及龜-膿腫分枝桿菌等非結核分枝桿菌感染，甚至可以鑒別結核分枝桿菌活菌感染和滅活結核分枝桿菌致敏的豚鼠，具有良好的安全性[2-3]。臨床研究顯示，重組11 kDa 蛋白安全性好，并與γ-干擾素釋放試驗(IGRA)檢測結果一致性良好[4-8]。將其作為新型結核變態反應原，結合皮膚試驗，有可能成為一種簡單便捷、特異性高的潛伏性結核感染篩查的體內診斷試劑。本研究擬對重組11 kDa蛋白進行兩方面評價，一是作為潛伏性結核感染篩查診斷試劑進行評價，二是作為潛伏性結核感染與卡介苗接種鑒別診斷試劑進行評價。在評價重組11 kDa蛋白時，同時進行IGRA與結核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)皮膚試驗的平行試驗，比較其與兩種方法檢測結果的一致性，為臨床應用提供研究基礎。

資料和方法

一、研究對象

由首都醫科大學附屬北京胸科醫院聯合北京市昌平區結核病防治所、北京市懷柔區結核病防治所和北京市大興區結核病防治所，在以上3個區的高校和工廠招募健康志愿者，招募時間為2014年7月至2016年3月。

納入條件：年滿18周歲，簽署知情同意書，身體健康。排除標準：(1)入組前曾與肺結核患者，特別是排菌患者密切接觸；(2)患有各種重要臟器疾病、糖尿病、自身免疫疾病、器官移植術后、接受免疫抑制劑或免疫增強劑治療、長期服用激素；(3)確定為人類免疫缺陷病毒感染或相關疾病；(4)患急性傳染病(如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎)、急性眼結膜炎、急性中耳炎、癲癇或精神疾病者；(5)肺內、外結核病，呼吸道癥狀不適者；(6)正在參加其他臨床試驗者，或在臨床試驗前3個月參加過其他任何臨床試驗者；(7)妊娠或哺乳期婦女；(8)過敏體質者，如對2種以上藥品或食物有過敏史者，或對本試劑組分有過敏者；(9)懷疑或確有藥品濫用、酗酒史；(10)知情退出者。經過測量身高，以及進行體質量、脈搏、血壓、胸部X線攝影(簡稱“胸片”)、血常規、血生化(肝功能和腎功能)、尿常規檢查，各項指標正常者入組，總計納入3001名。其中，男1611名，女1390；年齡18～65歲，中位年齡29歲。3001名志愿者中，記錄了2379名志愿者的卡痕信息，其中922例存在卡痕。

本研究經首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會批準，批準編號為2013-16。

二、試劑

重組11 kDa蛋白、TB-PPD、皮內注射用卡介苗和安慰劑由北京祥瑞生物制品有限公司提供。市售γ干擾素(IFN-γ)酶聯免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒購自英國Oxford Immunotec有限公司。

三、研究方法

1. 皮膚試驗：皮膚試驗采用同體雙臂分別對受試者進行重組11 kDa蛋白和TB-PPD皮膚試驗。于受試者右側手臂掌側前1/3處皮內注射0.1 ml 重組11 kDa蛋白(10 μg/ml)，同時于左側手臂相同位置注射0.1 ml TB-PPD(50 U/ml)，注射方法嚴格遵守《結核菌素皮膚試驗使用指導手冊》[9]。分別于注射后24、48、72 h測量重組11 kDa蛋白及TB-PPD皮膚反應的硬結和紅暈[記錄平均直徑，平均直徑=(最大橫徑+最大縱徑)/2]。試驗結果以72 h為準[9]，同時記錄局部水皰、壞死、淋巴管炎等情況。重組11 kDa蛋白皮膚試驗判定標準：紅暈及硬結平均直徑≥5 mm為陽性；以及無論平均直徑大小，只要局部出現水皰、雙圈、壞死或淋巴結炎也為陽性；紅暈及硬結平均直徑<5 mm為陰性。TB-PPD皮膚試驗判定標準與上述判定方法相同。

2. IGRA：采用結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)試劑盒進行檢測。所有試驗對象在皮膚試驗前均采集外周抗凝靜脈血不少于10 ml，應用淋巴細胞分離液制備外周血單個核細胞，每孔加入細胞1.0×106個。按試劑盒操作說明加入刺激原。判定標準：空白對照孔斑點數為0～5個時，用測定孔A和(或)測定孔B斑點數減去空白對照孔斑點數后結果≥6個；或空白對照孔斑點數≥6個時，測定孔A和(或)測定孔B斑點數≥2倍的空白對照孔斑點數，則判定為陽性。相反為陰性。

3. 卡介苗接種鑒別：在3001名志愿者中，3種檢測結果均為陰性的475名知情同意受試者，采用數字表法按隨機雙盲的原則，以2∶1的比例接種卡介苗和安慰劑，受試者首先進行生命體征的測量(主要包括體溫、心率和血壓)，正常受試者接受疫苗/安慰劑接種后在現場觀察30 min，無異常反應方可離開。接種安慰劑或卡介苗3個月(12周)后再次進行平行對照試驗。試驗開始前再次對志愿者進行脈搏、血壓、體溫、血常規、肝功能、腎功能、尿常規等檢查，然后進行重組11 kDa蛋白和TB-PPD的同體雙臂皮試試驗和IGRA檢測。分別于注射變態反應原后24、48、72 h觀察皮膚試驗局部反應和全身反應，并采用米尺測量皮膚硬結的橫徑和縱徑，計算每日硬結平均直徑。記錄所有的反應，以72 h結果進行判定。

四、統計學處理

應用Excel 2007軟件建立數據庫，統計分析采用SAS 8.2和Stata 14.0軟件。計數資料的統計描述以“百分率(%)”表示，組間陽性率的比較采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。組間一致性的評價采用“一致率(%)”和“一階一致性系數(the first-order agreement coefficient，AC1)”。AC1值是評價校正機會一致性因素后的一致性程度，其應用受結局分布情況影響程度較小，是評價診斷試驗結局一致性更為穩定的指標；AC1值越大表示一致性程度越高，AC1值≥0.75表示一致性好[10-11]。一致率和AC1值的計算方法為：一致率(%)=兩種方法判定結果相同的例數/總例數×100%；AC1值=(觀察一致性-機會一致性)/(1-機會一致性)。

結 果

一、健康志愿者潛伏性結核感染篩查結果

3001名志愿者中，選用重組11 kDa 蛋白作為潛伏性結核感染篩查試劑，檢測陽性率為32.2%(966/3001)；體外IGRA檢測陽性率為34.4%(1033/3001)；TB-PPD檢測陽性率為47.7%(1430/3001)。IGRA檢測陽性率與重組11 kDa蛋白相比，差異有統計學意義(χ2=22.787，P<0.001)；IGRA與重組11 kDa蛋白檢測一致率為93.4%(2804/3001)，AC1值為0.882(95%CI=0.866～0.898)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統計學意義(χ2=182.146，P<0.001)；TB-PPD與重組11 kDa 蛋白檢測一致率為60.6%(1819/3001)，AC1值為0.243(95%CI=0.207～0.279)，兩者的一致性較差。

二、卡介苗接種鑒別結果

475名3種檢測方法均為陰性的志愿者中，326名參加了卡介苗接種鑒別評價，其中失訪8名，318名志愿者接種3個月(12周)后再次進行平行對照試驗；149名接種安慰劑，其中失訪2名，147名志愿者接種3個月(12周)后再次進行平行對照試驗。共計465名完成評價。

接種卡介苗的志愿者中，重組11 kDa蛋白作為潛伏性結核感染檢測試劑，檢測的陽性率為1.3%(4/318)；IGRA檢測的陽性率為3.1%(10/318)；TB-PPD檢測的陽性率為56.3%(179/318)。重組11 kDa蛋白檢測陽性率與IGRA相比，差異無統計學意義(χ2=2.571，P=0.109)；一致率為95.6%(304/318)，AC1值為0.954(95%CI=0.929～0.979)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測的陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統計學意義(χ2=167.350，P<0.001)。重組11 kDa蛋白與TB-PPD一致率為42.5%(135/318)，AC1值為0.025(95%CI=-0.106～0.155)，兩者的一致性較差。

接種安慰劑的志愿者中，重組11 kDa 蛋白作為潛伏性結核感染篩查試劑，檢測的陽性率為4.1%(6/147)；IGRA檢測的陽性率為1.4%(2/147)；TB-PPD檢測的陽性率為17.7%(26/147)。重組11 kDa蛋白與IGRA陽性率的比較，差異無統計學意義(χ2=2.667，P=0.109)；重組11 kDa蛋白與IGRA的一致率為95.9%(141/147)，AC1值為0.957(95%CI=0.921～0.993)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測的陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統計學意義(χ2=15.385，P<0.001)；重組11 kDa蛋白與TB-PPD的一致率為82.3%(121/147)，AC1值為0.781(95%CI=0.690～0.871)，兩者具有較好的一致性。

討 論

潛伏性結核感染是指宿主感染結核分枝桿菌后對結核分枝桿菌抗原存在持續的免疫應答，但無臨床活動性結核病證據的一種特殊狀態[12]。潛伏性結核感染者約有5%～10%的概率會發展為活動性結核病[13]，為了更好地抑制結核病，控制傳染源，對潛伏性結核感染的篩查十分必要。

結核菌素皮膚試驗曾一度作為潛伏性結核感染的篩查方法，并據此估計了世界1/3的人口為潛伏性結核感染者[14]。但由于TB-PPD所含抗原成分復雜，與卡介苗及部分環境分枝桿菌存在交叉抗原，并不能有效區分卡介苗接種和結核感染，因此，在診斷潛伏性結核感染方面特異性較差。IGRA是近年發展起來的新型體外診斷方法，敏感度和特異度均較高，不受卡介苗接種及絕大部分非結核分枝桿菌的影響。但IGRA對實驗技術和條件要求較高，且價格昂貴，難以實現高通量檢測，WHO等國際組織并不推薦將IGRA作為中低收入國家潛伏性結核感染的篩查手段[15]。我國作為普遍接種卡介苗的國家，也是結核病高負擔國家，潛伏性結核感染人數巨大，需要簡便、特異和高通量的新型診斷方法。

為解決這一問題，選擇結核分枝桿菌中存在而卡介苗中丟失的ESAT-6基因，構建重組11 kDa蛋白，采用皮膚試驗方法，根據已感染結核分枝桿菌個體體內存在致敏的T淋巴細胞，再次接觸結核分枝桿菌或微量的結核分枝桿菌特異蛋白時，會產生遲發型細胞過敏反應，即Ⅳ型變態反應的原理，通過變態反應情況診斷機體是否感染結核分枝桿菌。

本研究將重組11 kDa蛋白用于健康人群潛伏性結核感染篩查的結果可見，其檢測陽性率與IGRA有較好的一致性。而與TB-PPD陽性率的一致性較差。而本研究中健康人群中至少有1/3已存在卡介苗接種過的卡痕，進一步說明了TB-PPD特異度差的缺陷。

將重組11 kDa蛋白用于卡介苗接種者中，其陽性率與IGRA結果基本一致；而與TB-PPD陽性率一致性較差。而在安慰劑接種人群中，重組11 kDa蛋白檢測結果與IGRA結果及TB-PPD結果的一致性均較好。由于TB-PPD既能用于結核病的臨床診斷，又能用于卡介苗接種后機體免疫反應的監測，在該研究中，卡介苗接種后的人群在疫苗接種3個月后使用TB-PPD進行結核感染的篩查，則大部分皮膚試驗陽性人群應為卡介苗接種后的陽性反應，而非感染結核的陽性反應，該結果也同時說明PPD無法區分卡介苗接種與結核感染，進一步證明了TB-PPD用于結核感染檢測特異度差。

綜上所述，本研究證實了重組11 kDa蛋白能鑒別卡介苗接種與結核感染，能克服PPD特異度差的缺陷。檢測結果與IGRA有較好的一致性，同時又避免了IGRA的操作繁瑣、難以實現高通量和試劑價格昂貴的問題。重組11 kDa蛋白在操作方法上有PPD 的方便性，在檢測結果上有IGRA的特異性，結合了兩種試劑的優點，經過大規模的臨床評價，將為潛伏性結核感染篩查提供一種準確、簡便的候選篩查試劑。