表型與分子藥物敏感性試驗對術后耐藥骨關節結核患者化療的指導與效果分析

盛杰 朱洋 地里下提·阿不力孜 唐偉 古甫丁 宋興華

骨關節結核是由于結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)侵入骨和關節而引起的化膿性破壞病變，病變易累及脊柱及髖、膝等大關節。骨關節結核作為最常見的肺外結核，近年來發病數量不斷攀升且面臨耐藥問題[1]。臨床上普遍存在重手術、輕化療的治療理念，標準化、經驗性的抗結核治療方案導致耐藥骨關節結核治療失敗、疾病復發等不良后果頻發[2-3]。傳統的表型藥物敏感性試驗(drug susceptibility test,DST)耗時較長，期間因無法準確判斷病情而導致用藥不當[4]。及時、準確的判斷MTB及其耐藥情況是指導臨床早期開展個體化治療、提高治愈率的重要措施[5]。本研究旨在根據表型及分子DST結果，對耐藥骨關節結核患者術后進行早期個體化抗結核藥品治療并隨訪，探討在DST結果指導下的個體化抗結核藥品治療方案的制定及療效評價，以期為骨關節結核的規范治療提供依據。

資料和方法

一、研究對象

連續選取新疆維吾爾自治區胸科醫院骨科2018年3—12月接受病灶清除手術、經臨床綜合方法(臨床表現、影像學、病理學結果均符合結核)診斷為骨關節結核的患者112例，其中脊柱結核76例，膝、髖關節結核26例，恥骨、髂骨結核10例；男46例，女66例，年齡4～83歲，中位年齡39.0歲。對術中標本同時采用BACTEC MGIT 960和MTBDRplus-分子線性探針技術(LPA)進行DST，兩種技術聯合共檢出耐藥患者23例。其中，男10例，女13例；年齡17～76歲，中位年齡41.0歲；初治患者6例，復治患者17例。

二、研究方法

取患者術中標本進行表型和分子DST檢測，確定耐藥患者及耐藥譜，并實施個體化抗結核藥品治療及隨訪，具體方法如下。

1．標本采集及處理：術中采集病灶處的膿液、肉芽組織、死骨、干酪壞死組織。為避免標本含菌量不均勻、分割標本易污染等因素，將肉芽組織、死骨及干酪壞死組織剪碎加入無菌磷酸鹽緩沖液研磨混勻備測，膿液標本采用N-乙酰左旋半胱氨酸-氫氧化鈉前處理后再行檢測。

2．分子DST檢測：采用德國Hain Life Sciences公司生產的GenoType?MTBDRplus試劑盒，具體操作步驟參照試劑說明。擴增完成后將產物與探針試紙條進行雜交，根據顯色結果進行是否耐藥的判讀。判讀標準：27個反應條帶中，所有野生條帶均顯色且突變條帶均缺失時為敏感；野生條帶缺失或突變條帶顯色為耐藥。

3．表型DST檢測：采用美國BD公司生產的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養監測系統及配套試劑，依據說明規范進行菌種鑒定及DST檢測。以生長單位(growth unit,GU)指數評估耐藥結果：含藥品培養管的GU值<100為敏感，≥100為耐藥。

4．個體化抗結核藥品治療方案的制定：術前未明確診斷為耐藥骨關節結核的患者，在DST結果報告之前，初治患者采用標準化抗結核藥品治療方案：3H-R-E-Z/9-15H-R-E；復治患者根據患者病史分析復治原因，評估是否有耐藥的可能性，依據既往治療方案，采用經驗性抗結核藥品治療方案。術前已明確診斷為耐藥骨關節結核的復治患者，在DST結果報告之前采用既往已知的DST結果為患者制定個體化抗結核藥品治療方案。術后1～2 d，即可獲取分子DST結果，根據結果重新評估并依據《WHO耐藥結核病治療指南(2016)》[6]和《耐藥結核病化學治療指南(2015)》[7]相關要求，由新疆維吾爾自治區胸科醫院耐藥結核病專家組結合患者分子DST結果、既往用藥情況、年齡、并發癥、相關藥品的可及性、可行性和患者的耐受情況及依從性等臨床實際情況進行綜合討論，在此基礎上制定初步個體化抗結核藥品治療方案；待表型DST報告出具后，根據耐藥譜進一步調整抗結核藥品治療方案。治療周期一般為18～24個月，最終療程根據隨訪情況確定。治療過程中，密切對耐藥骨關節結核患者實施隨訪和督導，觀察藥品效果及不良反應，動態、及時調整方案。

5．隨訪及相關判斷標準：耐藥患者術后每個月進行一次血常規、肝腎功能、血紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)復查；同時監測一般狀況及藥品不良反應。于術后1、3、6、12個月根據病變部位及類型選擇性地安排X線、CT或MRI復查，觀察植骨融合、膿腫及死骨吸收情況，判斷疾病轉歸。采用Bridwell標準[8]評價植骨融合情況：Ⅰ級為骨塊融合，重塑完全，骨小梁存在；Ⅱ級為骨塊完整，骨塊重塑不完全，無透亮區；Ⅲ級為骨塊完整，但上方或下方存在透亮區；Ⅳ級為骨塊塌陷，吸收，無骨性融合。采用疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)量表評估疼痛改善情況，量表總分為10 分，分值越高疼痛越嚴重：0分為無疼痛，1～3分、4～6分、7～9分、10分分別對應輕度疼痛、中度疼痛、重度疼痛、劇烈疼痛[9]。

6．臨床療效評價標準：隨訪時間為12個月，以“好轉”為臨床療效評價指標[10]，具體為：耐藥患者術后經個體化抗結核藥品治療≥12個月，并在術后12個月符合以下標準：(1)全身狀況良好，無發熱、盜汗等全身結核中毒癥狀，局部疼痛明顯減輕；(2)ESR 及CRP較發病期明顯降低，并持續多次復查逐漸趨于正常值范圍；(3)X線、CT等影像學檢查顯示原植骨部位位置穩定，基本達骨性愈合，周圍無異常陰影、新發病灶；(4)恢復基本活動和輕體力工作，無癥狀復發，無膿腫、竇道形成。

三、統計學處理

結 果

一、耐藥骨關節結核患者基本情況

MTBDRplus-LPA的DST結果報告時間平均為(48.0±9.6) h，BACTEC MGIT 960 DST結果報告時間平均為(33.0±4.0) d。112例骨關節結核患者中，BACTEC MGIT 960 MTB培養陽性44例，對培養陽性標本進一步行表型 DST檢測，檢出利福平耐藥18例，異煙肼耐藥20例。以表型DST檢測結果為參照標準，44例骨關節結核患者中，MTBDRplus-LPA檢出利福平耐藥21例，異煙肼耐藥18例，與表型DST結果一致性較高，見表1。

表1 分子與表型DST利福平和異煙肼耐藥性的檢測結果比較

二、耐藥骨關節結核患者術后個體化治療方案

23例耐藥骨關節結核患者術后均進行了個體化治療，具體治療方案見表2。

表2 23例耐藥骨關節結核患者個體化藥品治療方案

三、預后隨訪及臨床療效分析

1．個體化治療預后隨訪情況：23例耐藥骨關節結核患者術后個體化治療12個月，臨床轉歸為：(1)好轉21例，好轉率為91.3%(21/23)，術后切口愈合時間為9～23 d，平均(14.05±3.65) d；(2)復發1例(例3患者)，患者因個體化治療期間不規律服藥，導致手術切口破潰，竇道形成；(3)失訪1例(例6患者)。

2．個體化治療前后病灶愈合情況：21例療效評價為“好轉”的耐藥骨關節結核患者，術后12個月時，19例患者植骨達到Ⅰ級融合，2例患者達到Ⅱ級融合。植骨融合時間為4～10個月，平均(6.00±1.70)個月，植骨融合率為90.5%(19/21)，見圖1～9。

圖1～9 例17患者，女，29歲。臨床診斷為初治腰4、5椎體結核，分子及表型DST結果均診斷為利福平和異煙肼耐藥。圖1～5為患者術前行CT及MRI檢查的圖像，箭示腰4、5椎體骨質破壞，相應椎體間隙變窄，病灶向后壓迫脊髓，相應水平段發生繼發性椎管狹窄，雙側腰大肌結核性膿腫形成；圖6～9為患者末次隨訪CT復查及MRI圖像，箭示腰椎序列良好，結核病灶清除徹底，植骨位置滿意，植骨塊融合，原脊髓受壓部位壓迫解除，椎管形態恢復正常，雙側腰大肌形態正常，無異常及混雜信號

3．個體化治療前后ESR、CRP及VAS評分變化情況：21例療效評價為“好轉”的耐藥骨關節結核患者術前ESR為19～101 mm/1 h，平均(62.62±26.52) mm/1 h；CRP為23.35～89.91 mg/L，平均(52.29±22.40) mg/L；VAS評分為5～9分，M(Q1,Q3)為7.0(6.0，7.5)分。經個體化抗結核藥品治療，各項指標呈逐漸下降趨勢，總體差異有統計學意義(P=0.000)。術后12個月時ESR為5～19 mm/1 h，平均(14.39±5.24) mm/1 h，與術前比較差異有統計學意義(t=-8.25，P=0.000)；CRP為1.63～8.56 mg/L，平均(5.36±2.38) mg/L，與術前比較差異有統計學意義(t=-9.65，P=0.000)，21例患者ESR和CRP指標均已恢復至正常范圍(表3)；術后12個月時VAS評分為0～1分，平均1.0(0.0，1.0)分，與術前評分差異有統計學意義(q=7.30，P=0.000)(表4)。

表3 個體化治療前后不同檢測時間21例耐藥骨關節結核患者ESR和CRP的變化情況

表4 個體化治療前后不同測評時間21例耐藥骨關節結核患者的VAS評分變化情況

4．藥品不良反應：主要為胃腸道反應和藥物性肝損傷。23例患者在個體化抗結核藥品治療過程中，14例出現了胃腸道反應，其中12例輕癥者調整用藥頻次并輔以心理干預，2例嚴重者給予護胃、調整用藥劑量等對癥治療，14例患者均能堅持繼續治療。9例出現了藥物性肝損傷，8例為一過性肝損傷，丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶高于正常值2倍以上并有消化道癥狀的患者給予口服聯合靜脈注射給藥行護肝治療后均有好轉；1例患者丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶高于5倍正常值上限，護肝治療效果差，考慮為吡嗪酰胺所致，停用后改為乙胺丁醇，肝功能逐漸恢復正常。

治療方案中發生藥品不良反應排名前三的藥品分別為：利奈唑胺、阿米卡星、吡嗪酰胺。16例使用利奈唑胺的患者，12例分別出現頭暈、頭痛、肢體麻木、胃腸道不適及血小板降低等藥品不良反應；癥狀較輕者予以對癥治療，如口服營養神經及保護胃黏膜藥品對癥治療，癥狀較重者給予調整用藥劑量及頻次，癥狀均能緩解并繼續治療；其中血小板降低患者給予升血小板治療，如仍持續大幅度降低需停用利奈唑胺而選擇其他藥品替代。16例使用阿米卡星的患者，10例分別出現注射部位疼痛、聽力下降、頭暈及腎功能損傷等不良反應，在調整治療劑量、注射頻次及給予口服營養神經藥品等對癥治療后，癥狀均緩解。21例使用吡嗪酰胺治療的患者，9例分別出現關節疼痛、肝功能損傷及過敏癥狀，除出現過敏癥狀的患者外，其余患者在對癥治療的同時均能持續用藥。

討 論

一、耐藥骨關節結核患者術后個體化治療療效分析

骨關節結核臨床癥狀不典型，患者發病后通常首診于綜合醫院骨科，無論是實驗室檢測技術還是醫療專業水平，均無法保證患者能夠得到規范、合理、全程的個體化抗結核治療，導致骨關節結核患者復發、復治甚至繼發性耐藥。以營養支持為基礎，徹底清除病灶的手術為保證，科學、規范的術后藥品治療是耐多藥骨關節結核治療成敗的關鍵[1,11]。耐藥骨關節結核使用標準化或經驗性抗結核治療方案很可能因方案中個別藥品耐藥而使療效不佳甚至產生新型耐藥。本研究結果顯示，MTBDRplus-LPA檢測利福平、異煙肼耐藥性與表型DST結果一致率較高，但極大地縮短了報告時間，有助于早期、初步確定患者MTB耐藥譜，有針對性地早期制定個體化抗結核藥品治療方案或藥品不良反應調整方案，最大限度的保障患者用藥安全[12]。

在分子及表型DST指導下，本研究23例耐藥骨關節結核患者中，除失訪及復發患者，其余21例患者術后經個體化抗結核治療12個月，植骨融合率高達90.5%，VAS值較術前明顯降低(P<0.01)，10例患者分值為0，疼痛癥狀完全消失，說明患者經手術及個體化治療后，疼痛癥狀極大緩解；ESR和CRP水平較術前明顯降低并趨于正常范圍(P<0.01)，說明患者經個體化治療后機體炎癥感染程度逐漸降低。

二、DST指導下耐藥骨關節結核患者個體化治療方案的制定原則

新疆維吾爾自治區2015年耐藥結核病監測結果顯示：1803株MTB培養陽性的涂陽肺結核患者中，一線抗結核藥品(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素)總耐藥率高達31.39% (566/1803)，耐藥率排名前5位分別為異煙肼(13.03%)、鏈霉素(9.37%)、利福平(8.60%)、氧氟沙星(2.77%)和乙胺丁醇(0.39%)[13]。本研究通過對23例耐藥骨關節結核患者個體化治療及療效隨訪，在《WHO耐藥結核病治療指南(2016)》的指導下，結合新疆結核病耐藥基礎數據及經濟水平，探討耐藥骨關節結核在分子及表型藥敏試驗結果指導下，個體化抗結核藥品治療方案的制定原則，以期為本地區骨關節結核的規范治療提供科學依據，具體原則如下：(1)單耐藥和多耐藥結核病患者盡量選用藥敏試驗結果敏感的一線抗結核藥品。若敏感的一線抗結核藥品無法與原方案敏感藥品組成含4種藥品的有效方案時，可以按照順序依次從氟喹諾酮類藥品、二線注射類藥品中選擇，直至組合成功。(2)耐多藥、利福平耐藥、準廣泛耐藥及廣泛耐藥結核病患者治療方案一般從A組(一般建議選擇較高代的本類藥品)和B組中各選一種藥品+C組中選用的兩種藥品+Z(常規加用)或D組藥品。(3)避免在方案中同時選用2種同類藥品，如阿米卡星和卷曲霉素。(4)避免使用與已知耐藥藥品具有雙向交叉耐藥的品種：如環絲氨酸和特立齊酮。

在臨床實際診療過程中，WHO指南推薦的部分抗結核藥品因新疆地區難以獲得或無法持續供應、患者依從性差、藥品治療效果不理想、藥品費用高造成患者負擔重、藥品不良反應大等因素未納入本研究的個體化治療方案。具體說明如下：卡那霉素、鏈霉素的耳毒性和腎毒性較大；加替沙星、乙硫異煙胺、特立齊酮、氨硫脲為本地區難以獲得；貝達喹啉和德拉馬尼為新藥，國內應用較少，本地區難以獲得；亞胺培南/西司他丁和美羅培南因使用方法為靜脈滴注，患者無法長期堅持，且藥品成本高、患者經濟負擔重；阿莫西林-克拉維酸鉀治療效果一般，氧氟沙星和環丙沙星治療效果不理想。根據指南并結合本地區實際情況，本研究將利福平耐藥結核病和耐多藥結核病各組治療藥品篩選如下，以供本地區臨床醫師在實際治療過程中參考。 A組：氟喹諾酮類，左氧氟沙星和莫西沙星；B組：二線注射類藥品：阿米卡星和卷曲霉素；C組：二線口服類藥品：丙硫異煙、環絲氨酸、利奈唑胺和氯法齊明；D組：吡嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸異煙肼。

三、失訪、復發原因及對策

本研究在術后個體化治療隨訪過程中，出現失訪及復發患者的可能原因為：(1)2例患者均來自經濟發展水平不高、交通不便的偏遠地區，且患者自身因疾病無法從事正常工作，導致經濟水平下降，無法保證定期復查及規律治療，其中失訪患者原通訊信息失效且未定期復查，于術后第3個月失訪；(2)受文化程度影響，患者對骨關節結核危害性認知不足，自我健康管理意識薄弱，癥狀緩解即自行停藥；(3)治療過程中，藥品不良反應無法耐受，生活質量受到影響，造成患者減少用藥劑量甚至自行停藥；(4)受經濟水平的影響，作為抗結核治療基礎的營養支持無法保證，導致機體免疫力下降。以上原因提示，臨床醫師需要在診治及隨訪過程中不斷做好對患者及家屬的健康教育工作[14]，盡可能留存患者及家屬多種通信方式，定期、主動隨訪、督促患者按時復查，對患者治療期間產生的藥品不良反應及時處理，提高患者用藥依從性，規律完成療程才能保證治療成功[15]。

綜上所述，在表型DST檢測的基礎上輔以分子DST檢測，有利于個體化抗結核藥品治療方案的全面、快速制定，是盡早治愈耐藥骨關節結核的重要因素。同時，本研究作為回顧性研究，因骨關節結核耐藥患者術后抗結核藥品進行治療的周期較長，收集樣本例數有限，目前僅隨訪至12個月，暫未獲得患者18～24完成治療后的最終療效，存在一定的局限性。需開展前瞻性研究，進一步擴大樣本量，并對耐藥患者進行全程隨訪，方可對個體化治療方案、治療周期的合理性進行深入探討。