卡介苗的免疫保護機制及其改造策略進展

楊魯琦 沈鳴逸 沙巍 陳穎盈 王穎

結核病是慢性呼吸道傳染性疾病，以肺結核多見。世界衛生組織[1]《2019年全球結核病報告》估算，2018年全球約有1000萬例新發結核病及150萬例因結核病死亡的患者，中國結核病負擔位列全球第二。此外，有研究估計全球約1/4的人口存在結核感染[2]，提示潛伏感染者體內MTB的再激活可能是結核病防控的更大挑戰。

預防性疫苗接種是結核病防控的重要環節。卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)作為當今世界上應用了近百年，且唯一獲得臨床許可的疫苗，已成為結核病高負擔國家和地區新生兒強制接種的手段，呈現出一定的保護性。但有研究認為，BCG的抗結核保護時間不長于20年，僅在10歲以下兒童中表現出良好的免疫保護力[3]。故是否在成年人群中再次接種BCG以增強人群的抗結核免疫力成為了研究者關注的重點。現階段還缺乏重復接種BCG獲得有效免疫的證據，因此并不推薦重復接種BCG[4]；但是否可以通過改造BCG來提高其保護效力及時效將是近年來結核病防控領域的關注點之一。目前認為，可以通過在BCG中加載具有良好免疫原性的新結核抗原，或開發不同的疫苗形式(如重組BCG或新型MTB減毒株，或以結核蛋白為主要形式的亞單位疫苗等)來提高新型BCG的免疫保護效力[5]，但要注意人群接種BCG后的免疫狀態及接種者是否存在MTB感染史可能給新型BCG的免疫效應帶來的影響。筆者將圍繞當前BCG免疫保護機制和基于BCG的改造策略進行綜述。

一、BCG的抗結核免疫機制及其局限性

BCG是由法國醫生Albert Calmette與其助手Camille Guérin在甘油-馬鈴薯培養基上對牛分枝桿菌歷經13年230次傳代培養后分離獲得的減毒株[6]。自1921年第一次接種于新生兒后，BCG開始在全球范圍內廣泛應用。1933年，王良將BCG引入中國并在小范圍內實施接種，后于1979年在全國范圍內實施強制接種[7]。目前，BCG在我國的新生兒接種率達到99%，產生的保護力不僅能有效降低嬰兒罹患結核性腦膜炎和粟粒性肺結核的風險[8]，還能對抗其他感染性病原體(如呼吸道病毒等)的入侵，有效降低新生兒出生后1年內的死亡率[9]。

(一)抗結核免疫機制

BCG能夠編碼4000多種蛋白，抗原譜豐富，接種后可在機體內引起豐富的免疫應答反應。研究顯示，疫苗接種1～3 d后，BCG可誘導接種部位的固有免疫細胞在接種部位產生局部炎性細胞因子[如白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等]，并可招募單核細胞到達接種部位；9 d后，局部浸潤的單核細胞成為炎性因子的主要來源[10]。BCG的病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP；如肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和霉菌酸等)存在于BCG菌株的細胞壁中，可通過與固有免疫細胞表面的病原識別受體[pathogen recognition receptor，PRR；如補體受體、Toll樣受體(TLR)-2和TLR-4等]作用而啟動免疫應答[11]。隨后，疫苗接種部位的樹突狀細胞攜帶BCG抗原進入淋巴結，向初始T細胞遞呈BCG抗原，啟動適應性免疫應答。此外，被吞噬進入單核-巨噬細胞內的BCG還可通過細胞內模式識別受體——核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain-2，NOD2)受體介導的信號通路使其發生表觀遺傳修飾，最終導致細胞功能的改變[12]。

BCG主要誘導人體內產生輔助性T細胞1(Th1)。同時樹突狀細胞發揮其抗原交叉呈遞功能，引起CD8+T淋巴細胞免疫應答[13]。雖然目前普遍認為BCG引發的免疫應答以細胞免疫為主，但BCG接種者血清中可以檢測到MTB脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)特異性IgG水平顯著增加[14]，且LAM的糖成分——阿拉伯甘露糖(AM)的單克隆抗體在研究中顯示出保護作用[15]，因此推測體液免疫也可能在BCG誘導的免疫保護中同樣具有一定的意義。

(二)BCG保護力的局限性

盡管已有的研究結果顯示，接種BCG可以通過產生有效的固有免疫應答和適應性免疫應答介導抗MTB的免疫保護作用，但是BCG對抗結核感染的保護力仍存在以下4個方面的不足。

1.BCG菌株間保護力差異：世界衛生組織[16]認為，不同國家之間BCG的抗結核保護效力存在差別，但原因尚不明朗。目前，已在動物模型中完成比較共4類13株BCG亞株，結果發現不同BCG亞株的保護力存在差異：其中BCG-Phipps 株、BCG-Frappier株、BCG-Pasteur株和BCG-Tice株等BCG菌株(屬于DU2-Ⅳ組)的保護力較強，而包括BCG-Sweden株和BCG-Birkhaug株在內的DU2-Ⅱ組BCG菌株保護力相對較弱[17]。因此有人推測，BCG保護力在各國間出現差異是由于長期培養和傳代導致不同國家應用的BCG菌株間產生了基因多態性，包括序列的重復、缺失和單核苷酸多樣性。

2.BCG保護力的時效性：雖然有研究顯示，BCG免疫能夠在某些人群中表現出20年或者更長時間的保護效力，但明顯增加的20歲以上結核病患者的數量，則提示BCG可能無法提供長效保護[18]，可能是以下多種免疫學因素共同造成的。

1)免疫記憶 T 細胞數量不足：任何一種預防性疫苗接種后保護力的維持都依賴于免疫記憶功能。BCG誘導的保護性免疫應答主要由T細胞介導，因此特異性記憶性T細胞(memory T cells，TM)的持續存在和功能維持對于抗結核保護至關重要。其中，當中央記憶性T細胞(central memory T cells，TCM)再次受到抗原刺激時能迅速分化成效應T細胞(effector T cells，TE)而參與再次應答，對免疫保護的長期維持意義更大[19]。然而目前的研究結果顯示，BCG在成年人外周誘導產生的免疫記憶T細胞以效應記憶性T 細胞(effector memory T cells，TEM)為主，而TCM細胞數量偏少，這可能是BCG保護力存在時效性的重要原因[20]。

2)免疫記憶T 細胞耗竭：在結核病高發地區，影響BCG保護力減弱的因素也許不僅局限于TCM細胞產生數量的降低，長期接觸結核抗原導致TM細胞消耗或T細胞功能受損也可能是另一重要原因[20]。由于接觸結核抗原的概率高于其他地區，高發地區接種者體內結核抗原特異性TM細胞可能頻繁地產生應答，緩慢消耗抗結核特異性TM細胞池，最終導致BCG保護力持久性減弱[21]。同時，可觀察到患者體內TE表面程序性死亡配體-1(PD-L1)和PD-L2分子的表達上調，提示頻繁暴露于MTB高負擔環境下，不僅持續消耗TM細胞，也會不斷抑制T細胞免疫功能[22]。

3)Th17細胞數量減少：有研究報道，BCG在肺臟局部誘導產生的Th17細胞的含量與BCG的保護效力呈正相關[23]。但隨著接種時間的延長，Th17細胞的衰減可能導致BCG保護效力降低。

4)定植記憶性T細胞的衰減：由于MTB通過呼吸道感染，肺部定植記憶性T細胞(resident memory T cells，TRM)在抗結核免疫應答中位居一線，發揮的抗結核保護作用也日益受到關注[24]。然而，目前尚未見關于BCG皮內接種后肺臟局部TRM長期維持高水平的報道，其衰減亦可能導致BCG保護力具有時效性。

5)BCG 活菌在體內的存活時間：結核特異性T細胞對抗原的應答水平與BCG活菌的體內持留具有較強的關聯性，可能在一定程度上影響著BCG保護力的持續性。當小鼠體內BCG活菌被清除，其誘導的免疫應答水平亦會呈現逐漸減弱的趨勢[25]，其在接種部位的存活時間可能僅為4周左右[26]，尚未見BCG更長時間在胞內持留的相關報道。

3.注射途徑的影響：當前，BCG主要通過皮內接種，其他的接種方式也在不斷嘗試中。在最新非人靈長類模型中發現，靜脈注射BCG能極大地提高其保護力[27]。然而，由于BCG是一種活菌疫苗，靜脈接種是否會造成BCG在血液中的留存或播散，以及是否會導致被接種者形成新的感染，是靜脈接種面臨的最大的安全性挑戰。同時，也有學者提出通過鼻腔吸入BCG進行免疫[28]，其安全性和免疫保護作用也需要進一步實驗證明[29]。這些研究在未來能否在人群中應用目前還很難判斷，但均為BCG的作用機制研究和新的接種途徑提供了重要方向。

4.基礎疾病和其他因素的影響：接種者自身的基礎疾病和其他因素也對BCG的保護效力產生不可忽視的影響。如HIV感染、糖尿病、惡性腫瘤等疾病，以及空氣污染和低體質量指數(BMI)都可能削弱BCG的保護力[30-31]。當BCG接種者感染HIV后，其體內CD4+T淋巴細胞的數量和功能會逐漸降低，導致BCG免疫應答下降、保護力降低，成為結核病發病的重要誘因，也是目前MTB與HIV雙重感染防控的難點。

二、基于BCG的疫苗改造策略

來自世界衛生組織[3]的報告指出，BCG不能為全人群，特別是成年人提供足夠的抗結核免疫保護，新型抗結核疫苗的研發將成為結核病防控中的核心科學問題之一。新型抗結核疫苗的形式主要包含重組 BCG(rBCG)和亞單位疫苗。rBCG的優點在于其包含更廣譜的抗原且與自然結核感染有一定相似性。而亞單位疫苗僅含有MTB的部分抗原，具有安全、保護力良好的優點[31]，但如果作為初次免疫疫苗，其保護效果很可能弱于現有的BCG，可能更適用于BCG初次免疫后的加強免疫[5]。故在新型抗結核疫苗研發過程中，以BCG為基礎的基因工程改造策略成為主要研究目標，主要包含兩種：其一是改造BCG使其表達不同的結核抗原，提高改造后BCG的抗原多樣性和免疫原性；其二是通過改造BCG進一步增強宿主對其抗原的提呈能力[32]。

(一)增加現有BCG菌株的抗原多樣性

采用基因工程技術，在現有BCG菌株中加入MTB不同感染狀態下表達的特異性抗原，以增加BCG的抗原多樣性，繼而增強其誘導的抗結核免疫應答，是目前最為常用的改造策略。

1. 利用MTB復合群基因組與BCG的差異。與MTB相比，BCG全基因組缺失16個基因差異區域(region of differences，RD)[33]。這為改造BCG提供了重要的思路，即將RD區的部分基因整合到BCG中，構建可表達相應抗原的rBCG，有望提高疫苗對結核感染的特異性免疫保護力。

RD1在MTB致病過程中起著關鍵的作用。其表達的早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)作為MTB特異性抗原，已在結核病的免疫學診斷中得到廣泛應用。小鼠實驗結果顯示，將ESAT-6與雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)/單磷酰脂質體A(MPL)佐劑共同免疫小鼠后，可誘導產生ESAT-6的特異性T細胞反應，其對結核感染的保護力與BCG免疫相當[34]。目前已嘗試在BCG菌株原有的基因序列中加入RD1區，形成新菌株BCG∶∶RD1，在動物模型中可觀察到保護力的提高；然而，對免疫缺陷小鼠行靜脈注射BCG∶∶RD1后，小鼠肺、脾臟的菌載量為BCG母株的100～1000倍，且易誘發脾腫大和肉芽腫，可見BCG經此改造后毒力被增強[35]。這可能與用于重組的MTB抗原誘導的免疫應答能力過強有關。RD2僅在部分BCG菌株中存在，其編碼的MPT64蛋白可在結核感染者體內誘發遲發型超敏反應[36]。

2. BCG中存在過表達強免疫原性的保護性抗原也是目前增加BCG抗原多樣性的策略之一。Ag85家族是目前rBCG 構建中最常用的抗原，包含Ag85A、Ag85B和Ag85C 3個蛋白，是MTB生長過程中主要的分泌型蛋白。過表達Ag85A的rBCG可使小鼠脾臟細胞分泌的γ-干擾素(IFN-γ)水平上升，且可誘導強IgG2a抗體反應[37]。此外，脂蛋白家族中也存在具有強免疫原性的蛋白，如可在活動性結核病患者外周血中檢測到高免疫反應性脂蛋白Z(LppZ；由Rv3006基因編碼)，其免疫小鼠后，可誘導產生和BCG免疫相當的抗MTB免疫保護作用[38]，有望成為未來構建rBCG的新型候選抗原；其他如PstS3、Mpt83、RpfB等脂蛋白抗原均呈現出良好的免疫原性，亦可成為構建rBCG的重要候選抗原[39]。

(二)以增強宿主抗原提呈能力為目標的改造策略

德國馬普所Kauffmann教授課題組嘗試不同的rBCG構建策略。由于MTB中脲酶C可抑制吞噬體的酸化作用，阻礙吞噬體成熟，進而導致主要組織相容性復合體(MHC Ⅱ)分子表達和抗原提呈減少，使宿主免疫系統不能很好地發揮免疫學功效[40]。而李斯特菌的穿孔素O(LLO)則有利于吞噬體和溶酶體融合，可幫助細菌逃逸到被感染細胞的細胞質中，促進干擾素誘導黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)蛋白炎癥小體的激活、增強細胞自噬和凋亡。故Kauffmann課題組將原BCG中的脲酶C替換成穿孔素O，構建了具有更好免疫保護力的新型結核病疫苗——VPM1002[41]。VPM1002臨床Ⅰ期試驗開展于2008年，結果顯示，在接種人群中除了具有良好的安全性以外，還展現出較好的免疫原性，可誘導IFN-γ陽性的 T細胞和特異性抗體的產生[42]。繼而研究者在結核病高發地區的新生兒中進行臨床Ⅱ期試驗，進一步評估VPM1002的安全性。結果顯示，BCG和VPM1002均可誘導IL-17的免疫應答，且VPM1002的受接種者注射部位膿腫形成的占比低于BCG，進一步證實了VPM1002的安全性、耐受性和免疫原性[43]。目前，VPM1002正在開展臨床Ⅲ期試驗。

全球結核病疫苗基金會也采用過類似的策略開展BCG改造試驗。他們將原有BCG中的脲酶C替換為產氣莢膜梭菌溶素O(Pfo)構建rBCG菌株——AERAS-401，其在重癥聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中表現出良好的耐受性和安全性；第二代rBCG菌株——AERAS-422在動物實驗中也顯示出具有抗原多樣性及增強抗原提呈能力的特點，且優于BCG的免疫原性和免疫保護性[44]。但在人體臨床試驗Ⅰ期的受試者中有2名出現了水痘帶狀皰疹病毒的再激活，導致該疫苗的開發被中斷[45]。

三、rBCG的免疫策略

目前，rBCG的免疫策略理論上包括以新生兒為接種對象的rBCG初次免疫疫苗和用于BCG初次免疫地區的加強免疫用rBCG疫苗。筆者上面提及的兩種BCG改造策略，不論是增加結核抗原的多樣性還是增強宿主的免疫應答水平，構建出的rBCG均可作為初次免疫用疫苗。然而，我國作為結核病高負擔國家，BCG第一針接種通常在嬰兒出生后24～96 h內完成，而這個時間也是新生兒發生與疫苗接種無關的死亡或接種后異常反應的高發時期，如果將改造后的rBCG疫苗用于新生兒的初次免疫，要求監護人簽知情同意的可能性極低，處理偶合反應后的不良事件也會極其困難，故rBCG用于新生兒初次免疫的可能性幾乎為“0”[46]。所以，“BCG初免-rBCG再免”這一免疫策略成為現階段rBCG 可在我國臨床應用的唯一共識。

四、新型BCG疫苗研究的展望

盡管目前對于BCG接種后的免疫保護機制有所了解，并已經提出一些BCG重組改造策略，但仍有很多有待解決的問題。

1．如何選擇構建rBCG的基礎BCG菌株是目前面臨的問題之一。目前，對13株BCG菌株的全基因組進行解析后發現，不同BCG菌株的缺失基因在數量和種類上不盡相同。因此，深入探索不同菌株間保護力的差異和缺失基因間差異的關系，不僅對BCG菌株的選擇具有重要意義，也可為后續這些菌株的免疫原性和可能存在的免疫病理性提供更多的實驗數據支持。

2. 選擇新的結核抗原也是BCG改造的重要部分。目前，構建rBCG常用的抗原主要集中在Ag85家族，但是該家族分子所誘導的免疫保護作用亟待進一步的實驗結果支持。同時，由于MTB在不同感染狀態下的基因表達譜不盡相同，因此選擇其在潛伏感染、早期感染和(或)晚期感染狀態下的特征性抗原用于構建rBCG，有望實現對不同人群的全面保護。但免疫原性過強的蛋白(如ESAT-6)會導致免疫病理的發生，并不是理想的候選抗原。因此，用于重組的結核抗原的免疫原性強度也將成為抗原選擇的另一個重要標準。

3. 對于構建成功的rBCG，選擇接種人群也是另一個關鍵問題。由于各方面原因，當前在我國使用rBCG取代BCG可行性較低。但是否能夠在BCG免疫過的青少年或成年人中使用rBCG以延長抗結核保護力時間、降低人群MTB感染率，或是將構建成功的rBCG作為治療性疫苗，亦或是構建出具有足夠安全性的rBCG用于潛伏性結核感染人群，都將是研究者未來努力的方向[47-48]。

筆者在前期的研究中發現，不同年齡段的結核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測陰性人群對于存在于BCG中的不同結核抗原的響應強度和免疫應答能力不盡相同(待發表)；因此推測，不同年齡段人群對于加強抗結核免疫用抗原的需求也可能不同。而從需要接種的人群來看，結核病密切接觸者及參與其診療過程的醫務人員是實施再接種的首選人群；而結核病高發年齡段(15～25歲)人群也可成為潛在接種人群。因此，在考慮加強疫苗免疫前是否可以先對健康人群按年齡段或者其他指標初步篩選接種人群，利于實現特殊人群精準再免疫，發揮更有效的免疫保護作用。對于上述研究，值得做進一步探討。

4. BCG接種的馴化免疫(trained immunity)作用。有研究報道，嬰幼兒接種BCG后可以明顯降低其他病原體感染造成的死亡率，這可能與馴化免疫相關，即固有免疫細胞在適當的病原體刺激下可以通過表觀遺傳機制產生類免疫記憶樣功能，從而整體提高機體對其他病原體的免疫功能[49]。在最近發生的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)疫情中，有研究顯示各國COVID-19發病率與其BCG接種率呈負相關[50]。雖然這項研究僅局限于兩者之間存在相關性而非因果關系，但也可能再一次說明BCG接種后馴化免疫帶來的免疫保護。但在接種BCG的人群中，這種馴化免疫功能可以維持多長時間、在rBCG免疫后馴化免疫是否可以和T細胞協同發揮更好的保護作用，以及BCG接種后帶來的馴化免疫能否對COVIID-19有防治作用，均是未來值得做進一步探索的前沿問題。

綜上所述，關于BCG的免疫保護力及其改造策略的研究仍然具有很多未解決的科學問題，對其進行深入的探索將推動結核病防治的發展。