貝達喹啉、氯法齊明和德拉馬尼對常見致病性非結核分枝桿菌體外抑菌活性及耐藥機制的研究進展

孫晴 黃海榮 王桂榮

非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)系指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM常存在于自然環境中，為機會性致病菌。近年來， NTM 引起的感染呈逐漸上升趨勢，嚴重威脅人類健康[1-2]。NTM感染肺、淋巴結、皮膚等器官和組織的疾病稱為NTM病，以肺部受感染多見。NTM病往往作為繼發性或伴隨性疾病，患者通常伴隨慢性基礎疾病或免疫系統的損害，如患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)、惡性腫瘤、艾滋病(AIDS)等疾病。NTM病在臨床表現及影像學、實驗室檢查結果等方面與結核病相比無明顯差異，但二者的治療方案卻大相徑庭。此外，NTM致病的菌種繁多，不同菌種NTM對藥品的敏感性不同，針對不同菌種引起的NTM病的治療方案也存在較大差異。因此尋找對NTM治療效果較佳的藥品非常有必要。近年來，貝達喹啉(bedaquiline,Bdq)、氯法齊明(clofazimine，Cfz)及德拉馬尼(delamanid，Dlm)因對治療NTM病體現出了良好的治療潛力而受到廣泛關注。

雖然NTM種屬分布常具有地域特點，不同國家、地區報道的NTM菌種組成、菌種構成比例多存在明顯差異，但在多數地區鳥-胞內分枝桿菌復合群(M.aviumcomplex,MAC)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)和堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)為較常見的致病菌種。筆者將圍繞Bdq、Cfz和Dlm對常見致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥相關機制進行綜述。

Bdq對常見致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機制

Bdq是近40 多年來第一個上市的抗結核新藥，屬于二芳基喹啉類化合物。Bdq是一種三磷酸腺苷(ATP)合成酶抑制劑，通過與分枝桿菌的ATP合成酶C亞基結合，影響ATP合成酶質子泵生物學功能，導致ATP耗竭和內環境穩態失衡，從而達到抑菌或殺菌效果[3]。2012年經美國食品與藥品管理局批準，Bdq可用于治療耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)[4]。因Bdq對治療NTM病體現出了良好的治療潛力而受到廣泛關注。

一、Bdq對NTM的體外抑菌活性

《伯杰氏系統細菌學手冊》根據NTM的生長速度將其分為快速生長分枝桿菌(rapid growing mycobacterium,RGM)和緩慢生長分枝桿菌(slow growing mycobacterium,SGM)。Bdq為剛上市不久的新藥，美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute)或世界衛生組織(World Health Organization，WHO)還未界定Bdq對NTM的耐藥臨界值。Yu等[5]的研究建議Bdq對NTM(包括RGM和SGM)的流行病學臨界(epidemiological cut-off，ECOFF)平均值應為2 μg/ml；Pang等[6]建議Bdq對RGM的ECOFF為2 μg/ml，對SGM的ECOFF為1 μg/ml。

Yu等[5]的研究顯示，Bdq對SGM和RGM的絕大部分標準株具有很強的體外抑菌活性，但對SGM的抑菌活性要強于RGM；對于常見的致病性NTM臨床分離株，Bdq也體現出了良好的體外抑菌活性。Bdq對MAC和M.kansasii臨床分離株均具有較強的抑菌活性，抑制50%細菌生長的最低藥物濃度(MIC50)和抑制90%細菌生長的最低藥物濃度(MIC90)值均在較低水平。Kim等[7]的研究結果顯示，MAC和M.kansasii臨床分離株對Bdq的MIC50和MIC90均為0.016 μg/ml。Pang等[6]的研究結果表明，MAC臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.03 mg/L和≥16 mg/L；M.kansasii臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.06 mg/L和>16 mg/L。DeStefano等[8]的研究結果顯示，M.kansasii臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.06 μg/ml和>16 μg/ml。Brown-Elliott等[9]的結果顯示，MAC臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為≤0.008 μg/ml和0.015 μg/ml。

另外，Bdq對M.abscessus臨床分離株也有良好的體外抑菌效果，但要弱于對M.kansasii和MAC臨床分離株的體外抑菌效果。Kim等[7]的研究結果顯示，M.abscessus臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.062 μg/ml和0.125 μg/ml。Pang等[6]的研究結果表明，M.abscessus臨床分離株對Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.13 mg/L和>16 mg/L。Li等[10]的研究結果顯示，M.abscessus臨床分離株對Bdq的MIC50和MIC90分別為0.062 mg/L和0.125 mg/L。Yu等[5]的研究結果顯示，M.abscessus臨床分離株對Bdq的MIC90為2 μg/ml。Dupont等[11]的研究結果表明，在斑馬魚體內Bdq對M.abscessus依然有著良好的抑菌效果。

可見，Bdq在體外對緩慢生長的MAC和M.kansasii臨床分離株，以及快速生長的M.abscessus臨床分離株均表現出了良好的抑菌效果。

二、 NTM對Bdq耐藥的相關機制

盡管Bdq對MDR-TB和XDR-TB具有良好的治療效果，但仍存在耐藥問題。結核分枝桿菌對Bdq的耐藥主要存在以下幾種機制：atpE基因突變、Rv0678基因突變和pepQ(Rv2535c)基因突變[12]。研究顯示，NTM對Bdq的耐藥機制與結核分枝桿菌大體相似，卻又不盡相同，大致總結為以下幾種。

1.atpE基因突變：atpE基因編碼ATP合成酶的C亞基，是Bdq的主要靶點。耐藥菌株可以阻止Bdq與C亞基結合，從而阻斷Bdq的抗菌作用。Andries等[13]研究發現，恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)atpE基因發生了D32V突變。Aguilar-Ayala等[14]在對atpE基因序列測定時發現其63位丙氨酸轉變為蛋氨酸，這很可能是微黃分枝桿菌(M.flavescens)對Bdq 產生天然抗性的原因。Dupont等[11]在M.abscessus中對atpE基因進行單點突變時發現D29V和A64P會導致Bdq高抗性。

2.Rv0678同源基因突變：在結核分枝桿菌中，Rv0678是mmpL轉導系統的負調控因子，Rv0678突變可導致編碼mmpS5-mmpL5外排泵基因表達上調，從而使結核分枝桿菌對Bdq產生耐藥[15]。Li等[10]在對Bdq耐藥的M.abscessus中發現Rv0678的同源基因Mab_4383/Mab_4382和Mab_4384存在突變，導致mmpS5-mmpL5過表達；另外Mab_4384的缺失也會導致Bdq耐藥。

3.mmpT5突變：在M.intracellulare中mmpT5與mmpR5(Rv0678)作用相似，都編碼轉錄調節因子，調控mmpS5-mmpL5外排泵基因的表達。Alexander等[16]的研究認為，移碼突變導致了mmpT5功能喪失，與M.intracellulare對Bdq的低水平耐藥相關。

4.Mab_2299c突變：Mab_2299c屬于TetR轉錄調節子家族，通過調控Mab_2300/Mab_2301，進而調控mmpS/mmpL外排泵系統。Richard等[17]研究發現，在M.abscessus中Mab_2299c突變與對Bdq耐藥相關，也與對Bdq和Cfz產生交叉耐藥相關。

Cfz對常見致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機制

Cfz是 20 世紀 40 年代研制的抗分枝桿菌藥品，主要用于麻風病的治療，近年來開始用于治療MDR-TB。目前Cfz抑菌的作用機制尚不清楚，分枝桿菌的外膜似乎是Cfz作用的主要靶點[18]。

一、Cfz對NTM的體外抑菌活性

Luo等[19]和Li等[20]對NTM標準株的研究結果顯示，Cfz對SGM的體外抑菌活性要強于RGM。Cfz對不同NTM臨床分離株的體外抑菌活性差異較大，Cfz對M.kansasii臨床分離株的體外抑菌活性最強，而對M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株的體外抑菌活性較差。Luo等[19]的研究結果表明，91%(41/45)的M.kansasii臨床分離株對Cfz的MIC為0.031 μg/ml；Cfz對M.avium和M.intracellulare臨床分離株的抑菌活性也較好，ECOFF分別為1 μg/ml和2 μg/ml；而M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株對Cfz的MIC90值均約為8 μg/ml。van Ingen等[21]的研究表明，M.kansasii和MAC臨床分離株對Cfz的MIC中位值均較低(分別為MIC≤0.5 mg/L、MIC=1 mg/L)；M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株對Cfz的平均MIC值較高，分別為5 mg/L和2 mg/L。Shen等[22]的研究表明，M.abscessus臨床分離株對Cfz的耐藥率高達95%(19/20)，MIC90為32 μg/ml，而M.fortuitum耐藥率為59%(10/17)，MIC90為0.25 μg/ml。Huang等[23]的研究顯示，97.3%(73/75)的M.intracellulare臨床分離株對Cfz敏感；62.5%(5/8)的M.abscessus臨床分離株對Cfz耐藥。但Shen 等[24]的研究結果顯示，Cfz對M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株具有較強的抑菌活性，99.1%(116/117) 的M.abscessus和91.7%(44/48)的M.fortuitum臨床分離株對Cfz的 MIC≤1 mg/L。

這些研究的結論并不完全一致，可能與選擇的菌株數量、菌株來源不同有一定關系。此外，還有學者認為可能是由于存在交叉耐藥，在結核分枝桿菌中發現，Rv0678基因突變可導致對Bdq耐藥的菌株發生對Cfz的交叉耐藥[25]。而Luo等[19]也在NTM中發現了相似的交叉耐藥現象。

二、NTM對Cfz耐藥的相關機制

結核分枝桿菌對Cfz耐藥的機制主要有以下幾種：Rv0678基因突變、Rv1979c突變和pepQ(Rv2535c)突變[12]。但在NTM中目前僅報道有Rv0678同源基因突變和Mab_2299c突變。

1.Rv0678同源基因突變：Luo等[19]研究發現，M.intracellulare對Cfz 耐藥與Rv0678同源基因Asp92Glu和Ala153Pro突變有關，研究者通過Rv0678同源蛋白序列的對比，認為在M.intracellulare中92和153位點是兩處高度保守的位點，并認為對Bdq與Cfz 的交叉耐藥也與這兩處位點突變有關。

2.Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突變：Chen等[26]發現，在M.abscessus中Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突變會導致對Cfz耐藥。Mab_2299c是結核分枝桿菌Rv0452的同源基因，該基因調控外排泵mmpL4-mmpS4，是AcrR家族負轉錄調控因子。Rv0452和mmpL4-mmpS4在結核分枝桿菌中的組織結構與Rv0678和mmpL5-mmpS5相同，因此Mab_2299c的突變極有可能引起對Cfz耐藥。此外，該學者還在29株對Cfz耐藥的M.abscessus中發現，21株發生Mab_1483突變、16株發生Mab_0540突變，Mab_1483、Mab_0540被認為與對Cfz低水平耐藥有關。以上結論與Richard等[17]在M.abscessus中對Mab_2299c的研究成果高度相近。

Dlm對常見致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機制

2014年4月Dlm被歐洲藥品管理局人用藥品委員會批準為抗結核新藥。Dlm是經過結構改造后的硝基咪唑類衍生物，其作用機制是通過抑制分枝菌酸的合成而抑制細胞壁的生物合成[27]。

一、Dlm對NTM的體外抑菌活性

研究發現Dlm對M.kansasii臨床分離株表現出了很強的抑菌活性，而對其他NTM菌種，Dlm的抑菌活性似乎較差。Yu等[5]的研究發現，45株M.kansasii臨床分離株中有39株對Dlm的MIC為0.125 μg/ml；Kim等[7]的研究中，M.kansasii臨床分離株對Dlm的MIC50和MIC90分別為0.25 μg/ml和1 μg/ml，而MAC、M.abscessus臨床分離株對Dlm的MIC值很高，對MAC的MIC50和MIC90分別為8 μg/ml和>16 μg/ml，對M.abscessus臨床分離株的MIC50和MIC90均>16 μg/ml。Yu等[5]的研究也同樣表明，Dlm對M.intracellulare和M.abscessus臨床分離株幾乎沒有抑菌活性，對M.avium臨床分離株的抑制活性也較差：91.7%(33/36)的M.intracellulare臨床分離株、92.5%(37/40)的M.abscessus臨床分離株MIC值>32 μg/ml，54.5%(12/22)的M.avium臨床分離株MIC值>32 μg/ml。此外，Yu等[5]還發現，M.fortuitum臨床分離株對Dlm 100%耐藥(33/33)，MIC>32 μg/ml。

二、NTM對Dlm耐藥的相關機制

在結核分枝桿菌中ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC基因被報道與Dlm耐藥相關，Dlm經F420依賴性分枝桿菌硝基還原酶還原成其活性形式，F420隨后通過6-磷酸葡萄糖脫氫酶循環還原為還原形式，其中F420由fbiA、fbiB和fbiC基因編碼合成，而該還原酶由ddn(Rv3547)編碼，脫氫酶由fgd1(Rv0407)編碼[28-29]。

Yu等[5]在一株M.avium中發現ddn基因Thr79Arg和Ser86Cys 位點突變，被認為與產生對Dlm耐藥相關。其他基因突變目前在NTM中還未見報道。

小 結

大環內酯類藥品(以克拉霉素和阿奇霉素為主)被認為是治療MAC、M.kansasii的重要藥品[30-33]。治療上通常推薦克拉霉素或阿奇霉素為主的2種以上藥品治療，如乙胺丁醇、利福平、利福布汀等[34]。但是仍有部分患者出現對一線藥品不耐受，對大環內酯類藥品產生耐藥、治療失敗等情況。Cfz則可作為一種有潛力的補充性藥品，與一線藥品聯用可達到較好的抑菌效果。目前，有學者推薦在治療MAC時將利福平+大環內酯類藥品+乙胺丁醇這一組合換成Cfz+大環內酯類藥品+乙胺丁醇[35]。Jarand等[36]在對MAC感染患者進行隨訪后，也發現Cfz+大環內酯類藥品+乙胺丁醇這一組合治療效果更優；即使用Cfz+大環內酯類藥品+乙胺丁醇治療的患者較使用利福平+大環內酯類藥品+乙胺丁醇的患者痰培養陽性轉為陰性的陰轉率更高[100%(90/90)和 71%(10/14)；P=0.0002]。

大環內酯類藥品對MAC、M.kansasii等的抑菌效果良好，但對M.abscessus的體外抑菌活性較差[37-38]。有學者推薦在治療M.abscessus時應在阿米卡星、頭孢西丁、亞胺培南、替加環素、利奈唑胺中選擇3或4種藥品進行聯合治療[35]。盡管阿米卡星、頭孢西丁等藥品對M.abscessus有良好的抑菌效果[33,39-42]，但Cfz仍是一種有潛力的治療藥品。一些體外研究發現，當聯用Cfz+阿米卡星或Cfz+克拉霉素時，對M.abscessus臨床分離株有很強的抑菌效果：Shen等[24]發現，當Cfz與阿米卡星聯用時，100%(40/40)的M.abscessus臨床分離株對Cfz 的MIC值由原來的0.25～0.5 mg/L下降到<0.03125 mg/L。Ferro等[43]的研究結果表明，在治療時使用Cfz+克拉霉素或Cfz+阿米卡星聯用，比單一使用克拉霉素或阿卡米星的目標達成率高60%以上；在對M.abscessus感染進行治療時，Cfz的使用可以抑制單獨使用克拉霉素或阿卡米星治療時的復發。以上2位學者均認為Cfz和阿米卡星、克拉霉素之間存在著協同作用。Yang等[44]的臨床試驗結果顯示，Cfz和大環內酯類藥品聯合使用時，81%(34/42)的M.abscessus患者臨床癥狀好轉，31%(13/42)的M.abscessus患者影像學復查結果有所好轉，24%(10/42)的M.abscessus患者實現了痰培養陰轉。

展 望

近年來，Bdq、Cfz及Dlm因對NTM病體現出了良好的治療潛力而受到廣泛關注。繼續研究NTM對Bdq、Cfz和Dlm的藥物敏感性試驗是十分重要的，可為未來設立不同菌株對Bdq、Cfz和Dlm體外藥物敏感性試驗折點奠定相關基礎。此外，關于Bdq、Dlm對NTM病治療效果的臨床試驗較少，還需進行更多的研究和探索。在臨床上繼續探索Cfz與不同藥品的聯用方式及研究各藥品之間的相互作用，以便篩選最優聯用組合是非常重要的。在耐藥相關機制方面，一方面還需對已報道的耐藥相關基因進行驗證，另一方面則需要繼續探索新的與耐藥產生的相關機制。