新城疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的建立與應用

王素春，孫亞偉，樊擎瑩，黃保續(xù)，康京麗，汪 洋，劉華雷，張云香，王楷宬

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023；3.臨朐縣職業(yè)教育中心學校，山東臨朐 262605）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副黏病毒科腮腺炎病毒屬的禽副黏病毒I 型引起的高度接觸性禽類烈性傳染病，以呼吸道癥狀為主要特征，同時伴發(fā)神經(jīng)癥狀、胃腸道病變和頭部腫大。ND于1926 年首次暴發(fā)于印度尼西亞的爪哇和英國的新城，次年Doyle 才首次分離到病原并定名為新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）[1-2]。ND傳播迅速、傳染性極強、遍布五大洲，發(fā)病率和死亡率有時可高達100%，給養(yǎng)禽業(yè)造成了難以估計的經(jīng)濟損失[6-7]，因此被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病。在我國，ND 流行狀況也較為嚴重[3-5]。

NDV 基因組為單股負鏈RNA，其結(jié)構(gòu)模式為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別編碼6 個結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和RNA 聚合酶（L）。M、F、HN 蛋白參與病毒囊膜的合成。M 蛋白是一種多功能蛋白，主要成分為糖蛋白。該蛋白參與病毒裝配，因而既能促進病毒因子感染，也可控制病毒致病性；不僅能抑制宿主細胞蛋白質(zhì)合成，還能抑制RNA 轉(zhuǎn)錄[8-10]。根據(jù)病毒基因組長度、F基因和L基因序列，NDV 可分為兩大分支：Class I 和Class II[11]。Class I一般為低毒力或無毒力毒株，多從水禽中分離到；Class II 到目前為止共發(fā)現(xiàn)有18 個基因型，分別為基因 I—XVIII 型。我國已發(fā)現(xiàn)Class II NDV 的11個基因型（I—IX 型和XII 型、XV 型）。VIId 基因亞型毒株是我國流行最廣的強毒株，所占比例超過60%。我國ND 流行情況比較復雜，以VIId 基因亞型毒株為主，多種基因型毒株并存，既有疫苗無法完全保護的變異株，又有重組株，還有水禽、鴿、候鳥等攜帶的潛在威脅毒株[12-14]，因此需要研究適合我國流行毒株的高通量快速檢測方法。為此，本研究建立了NDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法，以期為該病監(jiān)測與防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Qubit 核酸濃度測定儀及配套試劑：購自Life Technologies 公司；超凈工作臺：美國Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf 公司；孵化器：德州誠信孵化設備有限公司；高速臺式離心機：德國Heraeus Biofuge primoR；熒光定量PCR 儀：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System。

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RT-PCR Kit Ver.2：寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 核酸提取試劑盒：德國QIAGEN 公司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific。異丙醇、無水乙醇、RNaseA 等，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 毒株和核酸提取

NDV、各亞型甲型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）等毒株：由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室保存，毒株詳細信息見表1。按照說明書操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA，并使用Qubit 核酸濃度測定儀及配套試劑測定RNA 濃度。

1.3 引物和探針篩選

從GenBank 中下載不同亞型、不同國家、不同分離時間的NDV 毒株的M基因序列，采用MEGA 6.0[15-16]進行序列比對分析，選取保守區(qū)域進行熒光檢測引物和探針設計，并對多條引物、探針進行組合、篩選與檢驗，以篩選出最優(yōu)引物和探針。

1.4 反應體系與反應條件

配制實時熒光RT-PCR 反應液，每管25 μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL、5U/μL TaKaRa ExTaqHS 0.5 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，以 及10 pmol/μL NDV forward、NDV reverse 和NDV probe 各0.5 μL，RNase Free dH2O 8.0 μL，待檢測樣品RNA 模板2 μL。

檢測反應條件設置為：第1 階段，42 ℃/5 min；第2 階段，95 ℃/10 s；第3 階段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集熒光），40 個循環(huán)。無Ct 值并且無擴增曲線，樣品判為陰性；Ct≤36，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，樣品判為陽性。

表1 NDV 毒株信息統(tǒng)計

1.5 特異性和靈敏度評估

采用上述反應體系與反應條件，檢測表1 中的病毒RNA 和DNA，以評估該檢測方法的特異性。提取的核酸經(jīng)Qubit 核酸濃度測定儀測定RNA 濃度后，將此病毒RNA 稀釋成1 ng/μL，再10 倍梯度依次稀釋成10-1～10-6ng/μL；各取2 μL 作為反應模板，按照前述加樣方法進行實時熒光RT-PCR 核酸擴增。

1.6 臨床樣本檢測

采集分布在13 個場點的各類家禽的咽拭子樣品共480 份，將其置于含有10%甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL、BSA 5 mg/mL）的PBS（pH7.2）緩沖液中，-80 ℃保存。將采集的樣品渦旋混勻后，4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒核酸[17]，-80 ℃保存。使用96 孔反應管加入上述反應體系，分別加入待檢樣品RNA 進行檢測。同時，參考國家標準《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550—2008），對480 份臨床樣品進行檢測，并對比檢測結(jié)果，分析本試驗建立方法在臨床檢測中的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針篩選

最終篩選出最適合引物（正向引物NDV forward、反向引物NDV reverse）和探針（NDV probe）。其序列已申請發(fā)明專利（申請?zhí)枺?01910124943.8）。對探針5'端進行羧基熒光素FAM 標記，3'端進行淬滅基團BHQ1 標記（表2）。其中NDV probe 為TaqMan 熒光探針。

表2 最適引物及探針序列

2.2 特異性與靈敏度

結(jié)果顯示，除各亞型NDV RNA 模板對應的試驗組出現(xiàn)了正常熒光檢測曲線外，其他非特異性病毒試驗組及陰性對照組均未出現(xiàn)擴增曲線。結(jié)果表明，此方法可以實現(xiàn)對NDV 的特異性檢測，且不與其他相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應。

本研究篩選的引物和探針組合能夠保證檢測時的靈敏性，檢測靈敏度為RNA 終濃度10-4ng/μL（圖1）。

2.3 臨床樣品檢測應用

用本試驗建立的NDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法和國家標準《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550—2008）中的RT-PCR 檢測方法，同時對13 個場點的480 份臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，25 份樣品在FAM 通道中有熒光信號，判定此25 份樣品為NDV 陽性。國標法檢測結(jié)果與該方法一致，κ值為1（P＜0.001）。結(jié)果表明，本試驗篩選的引物和探針通過熒光RT-PCR 方法檢測NDV 的準確可信度高，可用于臨床樣品檢測。

圖1 NDV 實時熒光RT-PCR 檢測靈敏度試驗結(jié)果

3 討論

ND 目前是我國主要的家禽疫病之一。在本研究所做的臨床樣品檢測中，檢測的13 個場點中有8 個感染了NDV，場群陽性率達到了61.5%（8/13）；480 份樣品中，共檢出25 份陽性，個體陽性率達到了5.21%（25/480）。NDV 可感染240 多種禽類，其中雞、火雞等對NDV 最易感，包括各個品種、年齡的雞，并且一年四季皆可發(fā)病[18-21]。除禽類之外，我國曾在病死的豬、牛、羊體內(nèi)也分離到了NDV。由此可見，NDV 的宿主范圍在擴大，這加大了ND 的防控難度[22-25]。NDV 不同分離株的毒力差異很大，導致該病的發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀、病理變化也有所差異，因而給診斷工作帶來了很大困難。

目前，用于NDV 檢測的方法主要有病毒分離、HA/HI 試驗及普通PCR 等。但是這些方法都有一定的局限性，不適于該病的快速檢測[26]。1991 年，Jestin 等[27]首先建立了NDV RT-PCR 檢測方法。在我國，2000 年謝芝勛等[28]建立了對NDV 快速檢測的RT-PCR 方法。本研究所建立的實時熒光RT-PCR 是在PCR 反應體系中加入了熒光基團，通過熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR 進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析[29]。這種方法可快速、準確、定性地檢測出NDV。

本研究在分析NDV 流行毒株基因序列后，以M基因為目的序列，設計了多個引物和探針，最終篩選出了一組最佳的引物和探針，建立了實時熒光RT-PCR 檢測方法，并將其運用于臨床樣本檢測。結(jié)果顯示，該引物和探針特異性好、靈敏度高。本研究使用的TaqMan 熒光探針法是由Livak 等[30]于1995 年首先報道的。這種方法實現(xiàn)了熒光信號積累與PCR 產(chǎn)物形成的完全同步，不僅避免了傳統(tǒng)SYBR Green I 染色法造成的污染，而且特異性強，避免了出現(xiàn)假陽性[23]。

有研究表明，M 蛋白序列與其他副黏病毒M蛋白同源性較小[10]。因此，本研究根據(jù)NDVM基因篩選引物探針而建立的實時熒光RT-PCR 檢測方法特異性好，不與AIV、IBV、ILTV 等其他病毒發(fā)生交叉反應，解決了ND 不易與其他禽病區(qū)分的困難。本研究設計引物和探針時，選擇比對分析的M基因序列中，既有比較古老的毒株序列、疫苗毒株序列，也有近年來我國新發(fā)的各個基因型毒株序列，涵蓋范圍較廣。與OIE 推薦方法相比，該方法對我國流行的NDV 更有針對性，特異性更好。該方法可檢測出Class I 分支的2 型、3 型、7 型和Class II 分支的I 型、II 型、VII 型的NDV。本研究建立的檢測方法靈敏度高，檢測下限達到了10-4ng/μL，與國家標準GB/T 16550—2008 中的RT-PCR 檢測方法作比對，發(fā)現(xiàn)樣品符合率達到100%。

4 結(jié)論

本研究建立的方法特異性好、靈敏度高，可以快速、準確地檢測NDV，可檢出我國當前流行的多個NDV 基因型，能夠滿足ND 的大規(guī)模流行病學調(diào)查需要和當前NDV 監(jiān)測的需求。