6 種狂犬病病毒ELISA 抗體檢測試劑盒的比對

（北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629）

狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一種高致死性人獸共患傳染病[1]。RABV 具有非常廣泛的宿主譜，幾乎可感染所有溫血?jiǎng)游铩Ｈ吮粠Ф救笸ǔ?huì)被感染，感染后病毒會(huì)侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）并導(dǎo)致狂犬病癥狀，而且一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%[2]。狂犬病作為致死率最高的傳染病，全球每年約有59 000 人死于該病[3]。在我國，狂犬病嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。因此，做好狂犬病監(jiān)測防控具有十分重要的意義[4]。

血清抗體檢測是預(yù)防狂犬病的關(guān)鍵。快速熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）和熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（fluorescent antibody virus neutralisation，F(xiàn)AVN）是目前世界衛(wèi)生組織（WHO）及世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）認(rèn)可和規(guī)定的檢測方法。這兩種方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是評估狂犬病疫苗接種效率最有價(jià)值及最可靠的方法。但二者不僅耗時(shí)、昂貴且都需要活病毒，對實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)人員操作技能要求高，操作繁瑣且單份樣品需求量多[5]。鑒于以上原因，現(xiàn)已開發(fā)了多種技術(shù)作為替代方法，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是較常用的檢測方法。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：省時(shí)、操作簡單、廉價(jià)，可高通量檢測，且不需要處理活病毒[6]，因而也不需要特定的實(shí)驗(yàn)室。目前市場上已有多種商品化的狂犬病病毒ELISA 抗體檢測試劑盒。它們的質(zhì)量水平對于狂犬病免疫防控具有較大影響。為檢測對比各試劑盒的有效性，確保RABV 抗體監(jiān)測結(jié)果準(zhǔn)確，對6種可購的商品化試劑盒進(jìn)行了測試比對試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑盒 本試驗(yàn)中所測試的6 種試劑盒購自6家試劑公司，其中：進(jìn)口的4種（編號A、C、D、F），國產(chǎn)的2 種（編號B、E）；阻斷法的1 種（A），其余為間接法。6 種試劑盒的詳細(xì)信息見表1。

表1 6 種試劑盒的詳細(xì)信息

1.1.2 血清樣本 犬血清樣本共計(jì)85 份，均為采集于北京市的臨床樣本。

1.1.3 設(shè)備與耗材 96 孔酶標(biāo)儀（SUNRISE 型）：奧地利TECAN 公司產(chǎn)品；37 ℃恒溫箱：購自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；精確的單道微量移液器和多道微量移液器：Thermofisher 公司產(chǎn)品；一次性移液器吸頭：Axygen 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 中和抗體檢測 對85 份血清樣本經(jīng)滅活處理后，委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所OIE狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室，利用OIE 認(rèn)定的FAVN 方法進(jìn)行抗體檢測，試驗(yàn)步驟參照OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》[7]進(jìn)行。

1.2.2 ELISA 抗體檢測 對85 份血清樣本，分別用6 種ELISA 檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測。檢測操作按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行，檢測結(jié)果按照試劑盒要求進(jìn)行判定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理分析 對檢測數(shù)據(jù)采用 Excel 處理，用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將6 種試劑盒的檢測結(jié)果與FAVN 檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。（1）結(jié)果一致性，應(yīng)用Kappa 檢驗(yàn)：Kappa系數(shù)＜0，極差；0～0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，極強(qiáng)[8]。（2）結(jié)果差異性，應(yīng)用配對χ2檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)）。（3）以中和試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算6 種試劑盒的特異性、靈敏度和符合率。

2 結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)分析

對85 份血清樣本，以FAVN 檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，檢出75 份陽性、10 份陰性。FAVN 及6 種ELISA試劑盒檢測85 份臨床血清的結(jié)果對比見表2。

表2 以FAVN 為標(biāo)準(zhǔn)的6 種ELISA 試劑盒檢測結(jié)果

將6 種試劑盒的檢測結(jié)果分別同F(xiàn)AVN 法的檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa 一致性檢驗(yàn)分析，得出各試劑盒的Kappa 值，如表3 所示。

表3 6 種試劑盒Kappa 一致性檢驗(yàn)結(jié)果

將6 種試劑盒的檢測結(jié)果分別同F(xiàn)AVN 法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。McNemarTest 的P 值顯示，試劑盒A、C、D 的檢測結(jié)果與FAVN 方法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），試劑盒B、E、F 的檢測結(jié)果與FAVN 法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 診斷效能評價(jià)

以FAVN 法為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表2 的檢測結(jié)果，分別計(jì)算6 種試劑盒的靈敏度、特異性和總符合率。具體比較結(jié)果見表4。

表4 6種試劑盒診斷效能評價(jià) %（份）

3 分析與討論

WHO 認(rèn)為，只有免疫后血清中的病毒中和抗體≥0.5 IU/mL 才具有效保護(hù)性，這就使得血清抗體檢測成為預(yù)防狂犬病環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵一環(huán)[9]。本研究通過對6 種試劑盒進(jìn)行對比分析，進(jìn)一步了解這些商品化試劑盒的實(shí)際效果，為狂犬病防控工作奠定技術(shù)基礎(chǔ)。Kappa 統(tǒng)計(jì)通常將觀察一致性與偶然一致性進(jìn)行比較，其值可作為檢測試劑或方法檢測結(jié)果可靠程度的參考[10]。χ2檢驗(yàn)是一種用途較廣的計(jì)數(shù)資料假設(shè)檢驗(yàn)方法，屬于非參數(shù)檢驗(yàn)范疇，主要應(yīng)用于推斷兩個(gè)樣本率或構(gòu)成比之間有無差別[11]。在獸醫(yī)研究中，人們常常采用χ2檢驗(yàn)比較兩個(gè)或多個(gè)率之間的差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。

本研究以FAVN 方法為標(biāo)準(zhǔn)，對6 種試劑盒進(jìn)行比較分析。根據(jù)Kappa 一致性檢驗(yàn)結(jié)果，Kappa 值越大，兩者一致性越高，表明結(jié)果可靠程度越高[8]。通過結(jié)果分析得出，試劑盒A 的一致性為弱，試劑盒B、F 的一致性為微弱，試劑盒C、D、E 為中度一致。根據(jù)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，試劑盒A、C、D 的檢測結(jié)果與FAVN 法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而試劑盒B、E、F 的檢測結(jié)果與FAVN 法存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)以上結(jié)果，本研究從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度初步分析了這6 種試劑盒的效果。然而，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件根據(jù)實(shí)際樣本進(jìn)行的Kappa 一致性檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)只針對統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，其結(jié)果可以作為評價(jià)可靠程度的參考，但不是判斷試劑盒優(yōu)劣的唯一指標(biāo)，還需要參考診斷效能及穩(wěn)定性等指標(biāo)。進(jìn)一步進(jìn)行診斷效能分析發(fā)現(xiàn)：6 種試劑盒中，試劑盒C、D 的靈敏度及符合率較好，均在90%左右；試劑盒A、E 較低，均在80%左右；試劑盒B、F 的表現(xiàn)較差，僅在70%左右。進(jìn)一步分析原因，在ELISA 檢測中，如果樣品稀釋倍數(shù)升高，則試劑盒的靈敏度會(huì)降低。試劑盒B、F 中樣品的稀釋倍數(shù)均為1:100，其余4 種均為1:10，這可能也是導(dǎo)致其假陰性較多、靈敏度較低的原因。

本研究中的樣品均為北京市采集的臨床樣品。由于北京市犬只免疫覆蓋率較高，樣品陽性多、陰性少的檢測結(jié)果會(huì)對試劑盒的特異性分析產(chǎn)生一定影響。但相較于標(biāo)準(zhǔn)血清，臨床樣品中復(fù)雜的抗體情況能夠更加客觀地反映試劑盒的效果，可為免疫效果監(jiān)測提供更加真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，試劑盒C、D 的一致性及診斷效能均有較優(yōu)的表現(xiàn)，在狂犬病病毒抗體檢測中具有良好的應(yīng)用價(jià)值；試劑盒A、E 檢測效果居中；而試劑盒B、F 的一致性水平較低，診斷效能較差，在實(shí)際應(yīng)用中易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。相比較，進(jìn)口試劑盒的檢測效果整體優(yōu)于國產(chǎn)試劑盒，但并不是所有進(jìn)口試劑盒都好于國產(chǎn)。6 種試劑盒中有5 種同為間接法，其檢測效果卻差異較大。間接ELISA 法對包被抗原的純度要求較高，否則易出現(xiàn)假陽性，雖然其靈敏度偏高，但同時(shí)也降低了試劑盒的特異性，影響結(jié)果判斷。綜上，品牌來源及類別等僅可作為選擇試劑盒的參考，而檢測效果應(yīng)是選擇試劑盒的首要考量因素。

因單份樣品量的限制，本試驗(yàn)只對一個(gè)批次的試劑盒進(jìn)行了比對，并未對批次間的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，所以暫且無法得知這6 種試劑盒的穩(wěn)定性情況，而在實(shí)際應(yīng)用中還需進(jìn)一步對試劑盒穩(wěn)定性進(jìn)行評測。市場上銷售的ELISA 試劑盒品牌較多，但從本研究對比結(jié)果來看，其效果有著較大差異，因此在開展狂犬病抗體監(jiān)測時(shí)，應(yīng)慎重選擇試劑盒，以保證試劑盒的有效性，這對做好狂犬病免疫監(jiān)測具有重要意義。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)市售的狂犬病毒商品化試劑盒的檢測效果存在差異，且這種差異與品牌來源（國產(chǎn)、進(jìn)口）及類型（阻斷法、間接法）無明顯相關(guān)性。建議在狂犬病血清抗體監(jiān)測工作中，以國際或國家認(rèn)可或規(guī)定的檢測方法作為標(biāo)準(zhǔn)，對商品試劑盒進(jìn)行一致性、差異性檢驗(yàn)和診斷效能評價(jià)，將檢測效果作為篩選試劑盒的首要考量因素，這樣可以保證試劑盒的有效性，從而確保狂犬病監(jiān)測與防控工作的有效執(zhí)行。