對蝦急性肝胰腺壞死綜合征不同檢測方法結果分析

郭書林，尤穎哲，陳何東，王藝紅，陳信忠，丁亦男，龔艷清，楊俊萍，陳長樂，陳炳穎

（1.廈門海關，福建廈門 361016；2.漳州市水產技術推廣站，福建漳州 363000）

我國對蝦養殖已有很長的歷史，但人工規模化養殖只有幾十年時間，其間因暴發性傳染病等原因，經歷了從起始、興旺，到衰退和恢復的發展過程。其中，副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）被認為是首要致病菌。2009 年，我國暴發一種對蝦疫病，隨后傳播到越南（2010 年）、馬來西亞（2011 年）、泰國（2012 年）。這些對蝦疫病的主要特征是急性肝胰腺壞死，發病階段為養殖早期的35 d 左右。2013 年，確定該病病原是某種細菌，初步確認為一種VP，同時確定該病為急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）[1]。研究[2-3]報道，該種菌株因攜帶了一種130 kb 大小的毒力質粒pVA1 而具有特殊的毒性，可以引起對蝦肝胰腺上皮細胞大量脫落等病理癥狀的急性肝胰腺壞死綜合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）。這種致病性VP 給對蝦養殖業造成嚴重危害，但不會引起腹瀉。

生化鑒定和血清學分型是檢測鑒定細菌的經典方法。PCR 技術通過對生物體的特異性RNA 或DNA 進行識別，已被廣泛應用于水生動物的病原檢測、鑒定。目前，一種AHPND PCR 檢測方法所用引物為AP3，其以一種毒力基因（序列分析顯示該基因編碼的蛋白質與細菌抗昆蟲毒素具有顯著的同源性）片段為擴增靶標，具有較好的準確性和靈敏性[4]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）是近年來發展起來的一種通過識別細菌表面蛋白的特異性而對細菌進行快速檢測鑒定的方法[5]。本試驗通過生化鑒定、血清學分型、MALDI-TOF-MS 鑒定，以及以AP3 為引物的PCR 方法，分別對從福建省南美白對蝦養殖場中分離到的9 株VP 進行檢測，比較各種方法檢測結果的一致性、相關性，從而確定一種準確快速檢測AHPNS 的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本處理

從福建省9 家規模化南美白對蝦養殖場，各采集10 只患病幼蝦活體，共90 份樣本，取肝胰腺。

1.2 主要儀器

MALDI Biotyper 高通量微生物鑒定系統：德國Bruker Dahonics 公司生產，參數設置為線性操作模式、正離子、基質抑制偏轉模式，脈沖離子提取時間為100 ns，相對分子質量為2～20 kD；VITEK-2 全自動細菌鑒定系統：法國生物梅里埃公司生產。

1.3 主要試劑

VP 診斷血清：寧波天潤生物藥業有限公司產品；VP 分離純化用培養基：青島海博公司產品；PCR mix 反應液：天根生物科技有限公司產品；PCR 引物：上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 弧菌分離 將1.1 中所述的90 份肝胰腺樣本，分別在TCBS 和弧菌顯色培養基平板中劃板，37 ℃培養24 h，挑取可疑單菌落在營養瓊脂培養平板上劃線培養，編號備用。

1.4.2 生化鑒定 取營養瓊脂培養平板上純化培養的菌落，用比濁儀將所檢測細菌濃度調整到0.5～0.63 麥氏濁度；利用VITEK-2 中的GN 卡，對VP 可疑菌株進行檢測。

1.4.3 MALDI-TOF-MS 鑒定 挑取營養瓊脂培養基上的單個菌落于1.5 mL 離心管中，加入1 mL生理鹽水，混勻、離心，洗滌2 次；將清洗干凈的細菌加入300 μL 無菌水，混勻后加入900 μL 無水乙醇，混勻，室溫固定3～4 min，10 000 r/min離心2 min，棄上清；向沉淀中加入50 μL 70%甲酸，混勻后再加入50 μL 乙腈，混勻；室溫放置3～4 min，10 000 r/min 高速離心2 min，吸取上清點靶；點1 μL 上清于樣品靶盤上，同時點1 μL標準溶液（校準），待液體干后立即點1 μL 基質溶劑。通過flexControl 軟件，采集數據圖譜；通過Biotyper 軟件對質譜圖進行分析和鑒定。得分2.300～3.000，表示可完全達到鑒定到種的水平；得分2.000～2.299，表示可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；得分1.700～1.999，表示有可能鑒定到屬的水平；得分0.000～1.699，表示沒有可信的鑒定結果。本研究均選取分值≥2.300 的結果作為待測樣本鑒定結果。

1.4.4 血清學鑒定 按照國家標準GB 4789.7—2013 的操作方法，使用抗O 和抗K 抗體，測定弧菌體（O）抗原和莢膜多糖（K）抗原血清型。

1.4.5 PCR 檢測 取營養瓊脂培養基上的菌落，按照商品化核酸抽提試劑盒的操作方法提取 DNA，并以此作為PCR 檢測用模板。反應體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3 上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL、TaqDNA 聚合酶0.5 μL、提抽物5 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃ 5 min，然后進行32 次循環（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃5 min，4 ℃ 保溫。PCR 檢測通過引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1 ）和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）擴增質粒pVA1 的基因片段，目的片段大小為336 bp。PCR 產物經測序、Blast 比對后，確定分離所得的菌株是否為引起AHPND 的VP 分離株。

2 結果

2.1 菌株分離

將從福建省9 家規模化對蝦養殖場采集的90份樣本，經劃線分離培養后，從各樣本長有可疑VP 菌落的TCBS 和弧菌顯色平板上，挑取≤5 個菌落進行VITEK-2 生化鑒定。其中從6 家養殖場樣品中分離到VP 菌株數量分別是21、21、13、12、10 和4 株，總計81 株。從檢出VP 菌株數量≥13 的3 家養殖場中，分別隨機選取2 個樣本中的VP 分離株各1 株（共6 株）；從其余3 家養殖場，分別隨機挑取VP 分離株各1 株（共3 株）。以這9 株VP 分離株作為MALDI-TOF-MS 鑒定、血清學分型、PCR 檢測用樣本。

2.2 MALDI-TOF-MS 鑒定

對2.1 中所述的9 株VP 分離株進行MALDITOF-MS 鑒 定。FT-18-1、FT-18-3、FT-18-4、XA-18-1 號分離株檢測得到的結果與VP 4a ISB 的匹配值分別為2.438、2.421、2.372、2.443；FT-18-2、XA-18-2、XA-18-3、XA-18-4、XA-18-5 號分離株檢測得到的結果與VP CCM5937 的匹配值分別為2.375、2.453、2.439、2.387、2.406；9 株分離株與MALDI-TOF-MS 中VP 數據庫匹配值均大于2.300，表明鑒定結果可信度很高。

2.3 血清型測定

對9 株VP 分離株血清型進行測定，發現4 株為O1:KUT 血清型，3 株為O1:K68 血清型，2 株為O3:K6 血清型。其中：O1，菌體抗原為13 種血清群中編號為O1 的血清群；KUT，莢膜抗原的血清型不能分型；K68，莢膜抗原的血清型為65 種血清型中編號為K68 的血清型；O3，菌體抗原為13 種血清群中編號為O3 的血清群；K6，莢膜抗原的血清型為65 種血清型中編號為K6 的血清型。

2.4 PCR 檢測

對9 株分離株進行PCR 檢測，發現4 株為引起AHPND 的VP 分離株，其余5 株未擴增出目的片段，判為陰性。9 株菌株的血清學、MALDITOF-MS、VITEK-2 和PCR 鑒定結果見表1。

表1 9 株菌株的血清學、MALDI-TOF-MS、VITEK-2 和PCR 鑒定結果比較

3 分析與討論

本試驗結果顯示，MALDI-TOF-MS 鑒定方法對AHPND 的PCR 檢測呈陽性和陰性的VP 均可以進行菌種的準確鑒定，且與經典的VITEK-2 鑒定結果吻合，說明這種新發現的AHPND VP 變異株不影響MALDI-TOF-MS 菌種鑒定的準確性。同時，MALDI-TOF-MS 技術較之于細菌生化鑒定方法更加簡便快捷，在AHPND VP 菌株的分離鑒定中，可以提高檢測效率；將MALDI-TOF-MS 與PCR 檢測方法相結合，在AHPND 的病原學分析、流行病學調查以及診斷、監測中可以取得準確的測定結果。

本研究發現，引起AHPND 的VP 分離株血清型為O1:KUT 和O1:K68，結合Kongrueng 等[6]在其研究中測定到的AHPND VP 血清型包括O1:KUT、O1:K33 和O1:K68，可以看到所測定的AHPND VP 分離株均為O1 血清型，而K 抗原血清型至少有3 種。根據上述情況可以假設，由兩種情況導致AHPND VP 血清型不同[6]：一種假設是，最初1 個VP 克隆變異為AHPND VP，隨后變異為多種血清型的AHPND VP；另一種假設是，致病質粒轉化進入了具有不同血清型的VP。因此目前分離到的AHPND VP 具有多種血清型。然而后一種假設很難解釋為什么沒有測定到除O1 血清型之外的AHPND VP。AHPND VP 是否在MALDI-TOF-MS測定中具有某些特征，還需要通過建立MALDITOF-MS 中大量AHPND VP 分離株分析結果的數據庫才能獲得。

4 結論

MALDI-TOF-MS 鑒定方法對這種新發現的AHPND VP 變異株可以進行菌種鑒定，而且較之于細菌生化鑒定方法更加簡便快捷；而將MALDITOF-MS 與PCR 方法相結合，可使AHPND 檢測結果更加準確。