一起由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病原溯源

李曉路 遇 婷 廖 文 張 巍 何 穎 祝 琳

細菌性食物中毒是指進食用被細菌或其毒素所污染的食物而引起的急性中毒性疾病，臨床表現為嘔吐、腹痛、腹瀉、發熱，其具有潛伏期短、起病急、病例集中的特點[1]。因此及時查找致病因子并采取針對性措施是處置食物中毒事件的關鍵。2018年4月，我市某高校發生一起食物中毒事件，累計發病患者10 例，經流行病學調查發現患者有共同進餐史，于進食后2 h 左右出現惡心、嘔吐、腹部不適、腹痛、腹瀉等癥狀。所有患者發病前24 h 再無其他共同進餐史，通過分析患者臨床癥狀、血常規檢測結果，初步判斷為細菌性食物中毒。本研究采用傳統培養法在采集的食物、生產加工環節和患者嘔吐物樣本中分離出了5 株金黃色葡萄球菌，并對分離菌株進行了腸毒素、藥物敏感性和脈沖場凝膠電泳（PFGE）溯源分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株食物中毒事件中分離的5 株金黃色葡萄球菌，菌株編號及來源分別為：AS12 來源于嘔吐 物；AS13 來源于蓋澆飯；AS14 來源于豆皮；AS15來源于熟雞肉；AS16 來源于炒菜鍋壁涂抹拭子；ATCC6538 金黃色葡萄球菌、沙門菌H9812 為實驗室保存標準菌株。

1.1.2 主要儀器與試劑主要儀器：酶標儀（Anthos 2010）；脈沖場凝膠電泳儀，Gel Doc XR 凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

主要試劑：金黃色葡萄球菌腸毒素金標快速檢測卡（北京陸橋技術股份有限公司）；SMaⅠ內切酶、瓊脂糖、葡萄球菌溶菌酶、蛋白酶K（大連寶生物有限公司）；抗生素（中國藥物研究所）。所有試劑均在有效期內使用。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測將食物中毒事件中分離的菌株分別接種到5 ml BHI 中，36 ℃培養24 h，取1 ml 培養液加入1.5 ml EP 管中，以10 000 r/min進行離心，時間5 min，取200 μl 上清液，加入等體積的樣品處理液，混勻，向檢測卡的3 個孔中每孔加入100 μl，按說明書要求15 min 后判定結果。同時以BHI 作為陰性對照進行此實驗。

1.2.2 藥物敏感試驗采用美國臨床與實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進行藥物敏感試驗，確定致病菌最低抑菌濃度（mimimal inhibitory concentration, MIC）[2]。根據CLSI 推薦的藥敏試驗抗生素選擇原則確定革蘭陽性菌適用的抗生素：苯唑西林（Oxacillin, OXA）、萬古霉素（Vancomycin, VAN）、四環素（Tetracycline, TET）、紅霉素（Erythromyci, ERY）、氯霉素（Chloramphenicol, CHL）、克林霉素（Clindamycin, CLI）、環丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（Trimethoprim, TMP/ Sulfamethoxazole, SMZ）。將菌懸液濃度調整至0.5 麥氏單位，細菌濃度相當于108 CFU/ml。取100 ml 稀釋于10 ml CAMHB 肉湯中，混勻（約為1×106CFU/ml），向96 孔藥敏板中加入菌懸液，每孔50 μl。同時做生長對照和空白對照，另外要用ATCC6538做標準菌株對照。36 ℃培養20～24 h 讀取藥敏試驗結果。當生長對照孔中有明顯生長，空白對照孔無菌生長，并且質控菌株的MIC 值在規定范圍內結果才可接受。根據MIC 值和對應MIC 值的解釋標準判斷被測試菌株對抗生素敏感度（S）、中介（I）、耐藥（R）。

1.2.3 PFGE 分子分型試驗按照國家風險評估中心提供的2016年《食源性疾病監測工作手冊》，制備菌懸液，加入葡萄球菌溶菌素制備PFGE plug，裂解，清洗plug，使用SmaⅠ限制性內切酶對金黃色葡萄球菌基因組DNA 進行酶切，沙門菌H9812 作為電泳Marker，制膠進行電泳[3]。14 ℃電泳19 h，EB染色，利用凝膠成像儀獲取圖像，運用Bio Numerics軟件對DNA 指紋圖譜進行聚類分析。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素結果

5 株金黃色葡萄球菌均產生A 型和C 型兩種腸毒素。

2.2 藥敏試驗結果

1 株來源于嘔吐物的菌株對ERY 耐藥，對OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感；另外4 株來源于食物和生產加工環節的菌株對這8 種抗生素均敏感。見表1。

表1 MIC 解釋標準及判定結果

2.3 PFGE 結果

5 株金黃色葡萄球菌經電泳凝膠成像，運用Bio Numerics 軟件根據條帶數量及位置對圖譜進行聚類分析，結果見圖1。可以看出分別來源于嘔吐物、豆皮、熟雞肉、炒菜鍋壁涂抹拭子的4 株菌呈現出完全相同的分子帶型，具有100%同源性；另外1 株來源于蓋澆飯的金黃色葡萄球菌分子帶型則不相同，與上述4 株菌株具有70.59%的同源性。

3 討論

圖1 來自食物中毒樣品中的5 株金黃色葡萄球菌聚類 分析結果

金黃色葡萄球菌適應力強、極易在環境中生存，并且可以通過多種方式和途徑污染食物。引起的食 物中毒在世界各國家占細菌性食物中毒的比例均較大[4]。我國20%～25%細菌性食物中毒病例由金黃色葡萄球菌引起[5]，是排在沙門氏菌和副溶血性弧菌之后的第3 大致病菌[6-7]。研究表明，造成金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子是腸毒素[8-9]。該菌一旦污染食品加工的任一環節，在適宜環境下，8～10 h甚至更短時間，便可大量繁殖并且產生腸毒素[10]。這種腸毒素采用一般的家庭烹飪方式無法將其滅活，100 ℃加熱30 min 仍具有活性[10-13]，因此金黃色葡萄球菌引起的食物中毒的概率較高。

本研究中食物中毒的5 株金黃色葡萄球菌均產生A 型和C 型腸毒素。產A 型腸毒素的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒較多，是國際上及我國導致食物中毒菌株最常見的腸毒素類型[5,8-9,14]，食物中毒事件中70%以上金黃色葡萄球菌均產生一種或多種腸毒素[15]。藥敏試驗結果顯示食物中毒污染菌株中1 株來源于嘔吐物對ERY 耐藥，對OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感。另外4 株來源于食物和生產加工環節的菌株對這8 種抗生素均敏感。鑒于目前金黃色葡萄球菌對部分抗生素產生耐藥性，臨床治療使用抗生素應結合藥敏試驗結果，以達到更好的治療效果，亦能減少耐藥菌株出現。

PFGE 是以核酸分析為手段的檢測細菌染色體結構特征的基因分型技術，具有重復性好、特異度高、結果容易判斷的優點，且不受細菌表型性狀干擾，被認為是細菌分子流行病學研究的“金標準”。在國外該技術被廣泛應用于食源性致病菌的病例監測、分子流行病學研究及暴發疫情的處理過程中，在疫情控制方面可發揮重要作用[16-19]。本研究中，2 株食物來源和1株生產加工環節來源菌株與1 株患者來源菌株100%同源，表明該種食物與此次食物中毒直接相關，另外1 株食物來源菌株與患者來源菌株70.59%同源，表明這種食物與此次食物中毒可能相關。由此可以斷定本次食物中毒是因為豆皮和雞肉中污染了金黃色葡萄球菌，烹炒加工過程中炒菜鍋也受到了該菌的污染，但是普通的烹飪方式并沒有將其消除，以至于發生了此次食物中毒事件。蓋澆飯中檢出的金黃色葡萄球菌與患者來源的菌株同源性沒有達到100%，可能與此次檢測過程中同一來源樣品只溯源1 株菌有關，如果多溯源幾株菌株，結果可能會有所不同。

此次將PFGE 分子分型技術應用于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件中在本地區尚屬首次。通過PFGE 將來源于患者、食物和生產加工環節樣本中檢出的金黃色葡萄球菌串聯在了一起，展示了其的遺傳關系，揭示了樣本之間的流行病學關系，明確地展示出了傳染源和傳播途徑，為相關部門處理此次事件提供了強有力依據。