UPLC-MS-MS快速測定煙草中131種農藥殘留量

師君麗 孔光輝 逄濤 李勇 吳玉萍 宋春滿

摘 ?要：采用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法建立了煙草中131種農藥殘留的同時測定方法，樣品用1%乙酸-乙腈萃取，氯化鈉和無水硫酸鎂鹽析，經PSA固相分散吸附劑凈化，采用正負離子多反應監測（MRM）模式檢測，外標法定量。結果表明，131種農藥在1～200 μg/L范圍內線性關系良好，決定系數（r2）均大于0.99，方法的檢出限為0.05～24.50 μg/kg，131種目標物的平均回收率為65.3%～112.4%，RSD為3.2%～7.3%。該方法簡便、快速、靈敏、可靠，適用于煙草中131種農藥殘留的快速測定。

關鍵詞：QuEChERS;超高效液相色譜-串聯質譜;煙草;農藥;殘留

Abstract： An analytical method for simultaneous determination of 131 pesticide residues in tobacco was established by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （ UPLC-MS/MS）. Tobacco samples were extracted with 1%（V/V） acetic acid-acetonitrile， salted out with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate， cleaned up with primary secondary amine PSA solide-phase dispersion， the extracts were then determined by UPLC-MS/MS in positive and negative ion modes and multiple reaction monitoring （MRM） mode， quantified by the external standard method. The results showed that all the 131 pescitides had good linearity in the ranges of 1-200 μg/L， with the coefficients of determination （r2） higher than 0.99. The limits of detection （LOD） were from 0.05 to 24.50 μg/kg. The average recoveries of all the pesticides were in the range of 65.3%-112.4% with the relative standard deviations between 3.2% to 7.3%. The method is simple， rapid， sensitive and reliable for determination of the 131 pesticide residues in tobacco.

Keywords： QuEChERS; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; tobacco; pesticides; residues

化學農藥是煙葉生產中防治病蟲害的重要技術手段，對保證煙葉產量和提高煙葉品質有舉足輕重的作用。目前農藥殘留問題日益凸顯，嚴重影響煙葉和卷煙質量安全。為了控制農藥殘留，減少吸煙危害，國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）農用化學品顧問委員會（ACAC）于2003年提出了煙草中99種農藥的最高指導性殘留限量（GRLS），2019年將農藥名單擴展至116種[1]，中國煙草總公司于2014年下發了YQ 50—2014《煙葉農藥最大殘留限量》，明確規定了煙葉中123種農藥的最大殘留限量（MRLS）[2]。

農藥種類繁多，對其殘留的分析已經由單一農藥殘留分析向多種農藥殘留分析發展。根據農藥性質不同，目前用于農藥多殘留分析的方法主要有氣相色譜-質譜法（GC-MS）[3-5]、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）[6-9]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[10-16]，文獻[13-17]采用UPLC-MS/MS法測定煙草中的多種農藥殘留，但覆蓋《煙葉農藥最大殘留限量》名單中的農藥種類較少（12～50種）;文獻[18-20]利用LC-MS/MS法測定煙草中的多種農藥殘留（73～118種），檢測種類更多，但分析時間較長（45～55 min）。

本研究采用優化后的QuEChERS前處理UPLC-MS/MS多反應監測（MRM）技術建立了煙草中131種農藥殘留的分析方法，采用分離效能更好、分析時間更短的UPLC，9 min即可完成煙草中131種農藥殘留的同時測定，相比以往的LC-MS/MS研究，擴充了檢測指標，縮短了分析時間，為煙草中多種農藥殘留的快速檢測提供了一種可靠的分析手段。

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，美國Waters公司;AB Sciex 5500三重四極桿質譜儀，美國Sciex公司;Talboys數顯型漩渦混合器，美國Troemner公司;高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;Millipore Simplicity超純水機，美國Millipore公司。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、乙酸銨，色譜純，美國Fisher公司。無水硫酸鎂，分析純，用前在650 ℃灼燒4 h，貯存于干燥器中備用。氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉，分析純。N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑（PSA吸附劑），美國Agilent公司。

2.4 ?質譜條件的優化

分別將131種農藥標準儲備液稀釋至0.01 mg/L，采用儀器自帶的蠕動泵以10 μL/min的流速注入離子源，分別在電噴霧正離子（ESI+）和負離子（ESI-）模式下進行母離子全掃描，確定各農藥的分子離子峰和電離方式，2，4，5-涕、2，4-滴、菌核凈和麥草威在負離子模式下響應值優于正離子掃描模式，其余農藥在正離子模式掃描下響應值最大，靈敏度最高。進一步優化錐孔電壓、離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力等質譜參數，對母離子進行子離子掃描，找到二級碎片離子，通過MRM掃描模式優化解簇電壓（DP）、碰撞能（CE）等參數，使131種化合物特征碎片離子的響應達到最大，優化出的最佳質譜參數見表1。

2.5 ?色譜條件優化

2.5.1 ?色譜柱的選擇 ?T3柱和C18柱是農藥檢測常采用的色譜柱。本實驗比較了Waters公司生產的 ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）4種色譜柱對131種目標農藥的出峰效果。C18柱對于甲胺磷、久效磷、氧樂果、苯線磷亞砜、特丁硫磷亞砜和噁唑菌酮這些農藥峰形不如T3柱，兩者比較，T3柱的峰形更好，出峰時間比C18柱更早，150 mm柱的分離度比100 mm的更好，綜合考慮，最終選擇ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱作為本研究的分離柱。

2.5.2 ?流動相體系的選擇 ?流動相的組成不僅會影響目標農藥的峰形和保留時間，還會影響到離子化效率，從而影響靈敏度。實驗考察了乙腈-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V）、5 mmol/L乙酸銨乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液3種流動相體系對目標農藥在分離度、峰形、靈敏度方面的影響。結果顯示，乙腈-水為流動相體系時，大部分農藥峰型較好，但霜霉威、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽峰型較差;加入乙酸銨對峰形改善不大，而且對部分農藥的響應會有抑制;加入甲酸不僅可以增強正離子模式下目標農藥的響應，提高靈敏度，還可以改善峰形，特別是對霜霉威和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽峰形改善較大，氧樂果、咪鮮胺、仲丁靈和二甲戊靈也獲得更好的峰型;三者相比較，引入甲酸的體系分離效果更好，因而選用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V）體系作為流動相。

2.5.3 ?流動相梯度的優化 ?流動相的配比對農藥保留時間、峰型和分離度都有較大影響。對于復雜樣品中的多種農藥組分分離，一般采用梯度洗脫，首先選擇高比例水相開始，保持一定時間后逐步提高有機相比例，使目標農藥保留時間延后，干擾物和目標物得到較好分離，有效降低基質效應。本文優化了流動相初始比例、不同梯度的流動相比例、梯度持續的時間及梯度變化時間，考察了不同流動相梯度洗脫參數下131種農藥的出峰效果，發現丁硫克百威、烯蟲酯峰型受流動相梯度變化影響非常大，較難獲得好的色譜峰。當采用1.4節的梯度洗脫程序時，上述兩種農藥獲得較好峰型，雜質與目標物分離較好，且所有農藥峰型尖銳對稱，響應明顯提高，131種農藥的總離子流色譜圖見圖1。

2.6 ?基質效應的考察

基質效應（ME）對檢測結果準確性的影響不容忽視。減少基質效應的措施有[21-24]：合適的樣品前處理方法，采用合適的色譜分離條件，采用同位素或性質相似的物質作內標校正，配制基質匹配標準曲線，稀釋，等。采用被測物的同位素作內標校正準確性最高，但因同位素標記物的種類少，而且價格昂貴，在多殘留分析中應用不多;且農藥性質差異較大，如果內標物選取不合適，將會影響檢測結果的準確性。本文在優化前處理方法，優化色譜分離條件，基質稀釋5倍等措施基礎上，通過目標農藥在純溶劑中的平均響應值（A，n=3）和基質匹配標準溶液的平均響應值（B，n=3），得到相對基質效應ME=B/A×100%[25]，當ME大于100%表示存在基質增強效應，小于100%表示存在基質抑制效應。本試驗考察了131種農藥在10 μg/L水平的相對基質效應，94種產生基質抑制效應，37種產生增強效應，其中，蚜滅磷、吡蚜酮、甲基嘧啶磷、吡蟲啉等39種化合物的ME超過（100±20）%，基質效應較明顯，只有苯霜靈、三唑醇、硫雙威等20種化合物的ME在（100±5）%以內，因此，采用基質匹配標準溶液進行校準來消除基質效應是可行的。文獻[17]報道多菌靈、吡蟲啉表現出較強的基質抑制效應，與本研究結果相符，文獻[18]報道涕滅威和苯霜靈受基質影響不大，本試驗結果表明苯霜靈受基質影響不大，但是涕滅威受基質影響較大，可能是采用的基質效應評判方法不同，結果也不盡相同。

2.7 ?方法的檢出限、定量限和回收率

將基質匹配標準溶液進樣檢測，并繪制標準曲線，以3倍信噪比確定檢出限（LOD），結果見表1，各農藥均具有較好的線性關系，決定系數（r2）均大于0.99。選擇空白煙草樣品，進行回收率和精密度考察，在10、50、100 μg/kg三個添加水平下進行加標回收試驗，每個加標水平重復測定5次，由表1可見，131種目標物的平均回收率為65.3%～112.4%，RSD為3.2%～7.3%，檢出限為0.05～24.50 μg/kg。

2.8 ?方法的應用

利用本法對CORESTA國際共同試驗組織方FAPAS提供的煙草樣品進行農藥殘留測試，spiked煙樣共檢出13種農藥，結果見表2，數據偏差與標準偏差的比值（Z值）在±2以內為良好結果的有12種，Z值小于±0.5的有8種，與參考值非常接近，說明了本方法的適用性和有效性。

3 ?結 ?論

采用QuEChERS—UPLC-MS/MS法同時測定煙草中131種農藥殘留，優化了提取凈化方法、色譜條件和質譜條件，同時考察了基質效應。最終采用1%乙酸-乙腈提取，PSA固相分散吸附劑凈化，正、負離子多反應監測（MRM）模式檢測，基質匹配外標法定量，9 min即可完成131種農藥的殘留檢測，131種農藥在煙草中3個加標水平下的平均回收率為65.3%～112.4%，RSD為3.2%～7.3%，檢出限為0.05～24.50 μg/kg。該方法簡便快速、靈敏準確，極大的提高了實驗室的檢測速度和檢測通量。

參考文獻

[1] CORESTA. Guide No 1. The concept and implementation of CPA guidance residue levels[EB/OL]. [2019-11-19]. https：//www.coresta. org/agrochemical-guidance-residue-levels-grls-29205.html.

[2] 中國煙草總公司. 煙葉農藥最大殘留限量：YQ 50—2014[S]. 北京：中國標準出版社，2014：1-5.

China National Tobacco Corp.. Maximum residue limits for pesticides in tobacco： YQ 50—2014[S]. Beijing： Standards Press of China， 2014： 1-5.

[3] 徐宜宏，黃瑩瀅，裴程程，等. QuEChERS –氣相色譜質譜法同時測定土壤中多種常見多氯聯苯及有機氯農藥[J]. 農藥，2018，57（5）：351-354.

XU Y H， HUANG Y Y， PEI C C， et al. Simultaneous determination of a variety of common polychlorinated biphenyl and organchlorine pesticide residues in soil by QuEChERS -GC/MS[J]. Agrochemicals， 2018， 57（5）： 351-354.

[4] 張耀海，趙其陽，焦必寧，等. 氣相色譜一質譜聯用快速檢測柑橘中55種農藥多殘留[J]. 食品與發酵工業，2010，36（7）：135-143.

ZHANG Y H， ZHAO Q Y， JIAO B N， et al. Rapid determination of 55 pesticide residues in citrus by gas chromatography with mass spectrometry detection[J]. Food and Fermentation Industries， 2010， 36（7）： 135-143.

[5] 蘇建峰，林立峰，鐘茂生，等. 山藥中146種農藥殘留的氣相色譜-質譜分析方法快速研究[J]. 藥物分析雜志，2010，30（2）：339-345.

SU J F， LIN L F， ZHONG M S， et al. Rapid determination of residual amounts of 146 pesticides in yam by gas chromatography-mass Spectrometry[J]. Chin Pharm Anal， 2010， 30（2）： 339-345.

[6] 沈偉健，余可垚，桂茜雯，等. 分散固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中107種農藥的殘留量[J]. 色譜，2009，27（4）：391-400.

SHEN J W， YU K Y， GUI X W， et al. Determination of 107 pesticide residues in vegetables using off-line dispersive solid-phase extraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（4）： 391-400.

[7] 陳曉水，邊照陽，唐綱嶺，等. 氣相色譜-串聯質譜技術分析煙草中的132種農藥殘留[J]. 色譜，2012，30（10）：1043-1055.

CHEN X S， BIAN Z Y， TANG G L， et al. Determination of 132 pesticide residues in tobacco by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2012， 30（10）： 1043-1055.

[8] 孟祥龍，張云清，范廣宇，等. 加速溶劑萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定糧谷中的51種農藥殘留[J]. 食品科學，2016，37（22）：216-223.

MENG X L， ZHANG Y Q， FAN G Y， et al. Determination of 51 pesticide residues in cereals using accelerated solvent extraction and gas chromatography-triple quadrupole-tandem mass spectrometry[J]. Food Science， 2016， 37（22）： 216-223.

[9] 尹銳，孫鵬，于衛松，等. 氣相色譜-四極桿飛行時間質譜分析煙草中184種農藥殘留[J]. 中國煙草科學，2018，39（6）：79-90.

YIN R， SUN P， YU W S， et al. Determination of 184 pesticide residues in tobacco by gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry[J]. China Tobacco Science， 2018， 39（6）： 79-90.

[10] 黃志波，吳春梅，程雪梅，等. 超高效液相色譜-質譜/質譜法測定葉菜中11種氨基甲酸酯農藥殘留[J]. 熱帶農業科學，2012，32（3）：69-73.

HUANG Z B， WU C M， CHENG X M， et al. Rapid UPLC-MS/MS determination of residual of 11 carbamate pesticides in leafy vegetables[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2012， 32（3）： 69-73.

[11] 賈瑋，黃峻榕，凌云，等. 高效液相色譜-串聯質譜法同時測定茶葉290 種農藥殘留組分[J]. 分析測試學報，2013，32（1）：9-22.

JIA W， HUANG J R， LIN Y， et al. Determination of 290 pesticide residues in tea by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis， 2013， 32（1）： 9-22.

[12] 林濤，邵金良，劉興勇，等. QuEChERS -超高效液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中41種農藥殘留[J]. 色譜，2015，33（3）：235-241.

LIN T， SHAO J L， LIU X Y， et al. Determination of 41 pesticide residues in vegetables by QuEChERS-ultraperformance liquid chromatographytandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2015， 33（3）： 235-241.

[13] 石杰，嚴會會，劉慧民，等. LC-MS/MS 方法分析煙草中的38種農藥殘留[J]. 中國煙草學報，2011，17（4）：16-22.

SHI J， YAN H H， LIU H M， et al. Determination of 38 pesticide residues in tobacco by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2011， 17（4）： 16-22.

[14] 朱文靜，高川川，樓小華，等. LC-MS/MS 快速測定煙草中57種農藥殘留[J]. 中國煙草學報，2013，19（2）：12-16.

ZHU W J， GAO C C， LOU X H， et al. Rapid determination of 57 pesticide residues in tobacco leaves by LC-MS/MS[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2013， 19（2）： 12-16.

[15] 宋春滿，吳麗君，和智君，等. UPLC-MS-MS 快速分析煙草中的農藥殘留[J]. 分析試驗室，2014，33（12）：1434-1438.

SONG C M， WU L J， HE Z J， et al. Rapid determination of multi-residue in tobacco by UPLC-MS-MS[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2014， 33（12）： 1434-1438.

[16] 熊巍，韶濟民，龐夙，等. UPLC-MS/MS法測定煙草中12種常用農藥殘留量[J]. 中國煙草科學，2015，36（1）：5-9.

XIONG W， SHAO J M， PANG S， et al. Determination of twelve common pesticides residues in tobacco by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（1）： 5-9.

[17] BERNARDI G， KEMMERICH M， RIBEIRO L C， et al. An effective method for pesticide residues determination in tobacco by GC-MS/MS and UHPLC-MS/MS employing acetonitrile extraction with low-temperature precipitation and d-SPE clean-up[J]. Talanta， 2016， 161： 40-47.

[18] YANG F， BIAN Z Y， CHEN X S， et al. Analysisi of 118 pesticides in tobacco after extraction with the modifief QuEChERS method by LC-MS/MS[J]. Journal of Chromatographic Science， 2014（52）： 788-792.

[19] 嚴會會. 煙草中農藥多殘留體系的液相色譜—串聯質譜分析方法研究[D]. 鄭州：鄭州大學，2011.

YAN H H. The study of pesticides multi-resdue system in tobacco by liquid chromatography-tandem mass spectrum analysis method[D]. Zhengzhou： Zhengzhou University， 2011.

[20] 中國煙草總公司. 煙草及煙草制品 多種農藥殘留量的測定 第1部分：高效液相色譜-串聯質譜法：YC/T 405.1—2011[S]. 北京：中國標準出版社，2011.

China National Tobacco Corp.. Tobacco and tobacco products- determination of multi-pesticide residues-Part 1： High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method： YC/T 405.1—2011[S]. Beijing： Standards Press of China， 2011.

[21] TRUFELLI H， PALMA P， FAMIGLINI G， et al. An overview of matrix effects in liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Mass Spectr Rev， 2011， 30： 491-501.

[22] 王立琦，賀利民，曾振靈，等. 液相色譜-串聯質譜檢測獸藥殘留中的基質效應研究進展[J]. 質譜學報，2011，32（6）：321-332.

WANG L Q， HE L M， ZENG Z L， et al. Progress in matrix effect of veterinary drug residues analysis by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. J Chin Mass Spec Soc， 2011， 32（6）： 321-332.

[23] 蘇萌，艾連峰. 液相色譜-串聯質譜基質效應及消除方法[J]. 食品安全質量檢測學報，2014，5（2）：511-515.

SU M， AI L F. Matrix effects and elimination methods of liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Food Safety and Quality， 2014， 5（2）： 511-515.

[24] 張愛芝，王全林，曹麗麗，等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中250種農藥殘留[J]. 色譜，2016，34（2）：158-164.

ZHANG A Z， WANG Q L， CAO L L， et al. Determination of 250 pesticide residues in vegetables using QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（2）： 158-164.

[25] PATEL D. Matrix effect in a view of lc-ms/ms： an overview[J]. International Journal of Pharma and BioSciences， 2011， 2（1）： 559-564.