內質網應激在心血管疾病中的研究進展

劉珂珂，黃 涯，呂 夢，婁利霞，程 涓，聶 波，張冬梅，吳愛明，趙明鏡

內質網穩態的喪失是多種心血管疾病的病理基礎。內質網非常活躍，易受到環境因素的影響。在缺氧、缺糖、三磷酸腺苷耗竭、鈣超載等內外環境應激因子刺激下，細胞均可引起內穩態失衡，使未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網腔積聚，繼而激活蛋白質質量控制系統，對蛋白質合成和降解做出適應性調整，以恢復其正常功能。根據誘發原因的不同，內質網應激可分為3類：未折疊/誤折疊蛋白激發的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)、過多表達的蛋白質經內質網膜轉運激發的過負荷反應以及固醇剝奪激活的級聯反應。其中，以UPR與心血管疾病聯系最為密切。適度的內質網應激是細胞的自適應反應，有利于內質網功能的恢復，為細胞生存提供了保障。然而，如果內質網應激是嚴重或持續的，蛋白質錯誤折疊未得到解決，則會進一步誘發炎癥和凋亡，以清除受累細胞。本研究就內質網應激UPR在幾種常見心血管疾病中的研究進展進行綜述。

1 內質網應激的信號轉導途徑

內質網應激主要包括蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇需要蛋白1(inositol-requiring protein 1，IRE1)、激活轉錄因子-6(activating transcription factor 6，ATF-6)3條信號轉導途徑[1]。正常情況下，免疫球蛋白結合蛋白(BIP)/葡萄糖調節蛋白78(GRP78)與PERK、IRE1、ATF-6結合存在，發生內質網應激UPR時，GRP78與誤折疊蛋白或未折疊蛋白結合，從而釋放PERK、IRE1、ATF-6，引發下游的級聯反應。其中IRE1和PERK通過細胞質內結構域二聚化和自身磷酸化而被激活。IRE1可以誘導人X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP-1)表達，XBP-1蛋白與UPR及內質網相關降解途徑(ER-associated degradation，ERAD)基因促進子結合，促進降解。PERK則磷酸化真核細胞起始因子 2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)第51位絲氨酸，阻斷蛋白質信使RNA(mRNA)的翻譯，也可選擇性活化轉錄因子-4(activating transcription factor-4，ATF-4)的翻譯，從而增加伴侶分子的合成，上調與氧化應激相關基因的表達。ATF-6則以囊泡轉移的途徑轉入高爾基體，被蛋白酶水解成活性轉錄因子。活化的ATF-6被轉移至細胞核，與通用性轉錄因子(nuclear factor-Y)以二聚體形式結合于內質網應激基因的啟動元件，進而誘導這些蛋白的轉錄表達。通過上述過程，瞬時抑制蛋白質翻譯，增強內質網的蛋白質折疊能力，加快內質網相關的降解，使變性蛋白得以清除，從而恢復細胞內穩態[2]。如果以上3條途徑仍不能緩解，過度的應激則會激活ERAD過程，通過泛素化靶蛋白進而被蛋白酶體所水解，也可激活細胞自噬及凋亡途徑。通過內質網特有的半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、c-Jun氨基末端激酶通路引起細胞凋亡。

2 內質網應激與心血管疾病

2.1 心肌梗死 急性心肌梗死是威脅人類健康的重大疾病。介入治療使心肌梗死病人的生存率大幅提高，但介入術后往往會發生不同程度的缺血/再灌注損傷(infarction/reperfusion，I/R)，在一定程度上影響了療效。已有證據表明，內質網應激及其引起的凋亡在I/R這一病理過程中發揮著重要的作用。內質網應激在心肌I/R時被激活，GRP78作為內質網應激的主要調節因子此時表達上調。有研究表明，GRP78可以刺激蛋白激酶B(Akt)信號通路使其表達增強，從而抑制活性氧的積累，繼而發揮減輕心肌細胞損傷的作用[3]。而ATF-6作為GRP78的下游分子，在心肌梗死及I/R病理過程中也發揮著保護性作用。有研究表明，激活ATF-6可以減輕氧化應激，調節鈣離子平衡并減輕內質網壓力[4]。ATF-6的抗氧化作用與其增加過氧化氫酶等抗氧化蛋白的表達，阻斷線粒體Ras系統的激活有關[5]。相反，基因敲除ATF-6會影響腎上腺素-胰島素樣生長因子信號傳遞，進而使腦內富集的Ras同系物(Ras homologue enriched in brain，RHEB)基因表達雷帕霉素靶蛋白(mTOR1)增加，抑制自噬，導致心肌進行性肥大[6]。

雖然，GRP78和ATF6的激活這一適度的內質網應激反應對機體有益。但是，在心肌梗死及I/R病理過程中的內質網應激往往是持續而嚴重的，表現為CHOP和Caspase-12的激活，最終導致細胞過度凋亡，心功能受損[7]。因此，抑制過度的內質網應激可作為治療心肌梗死減輕I/R的重要干預途徑。研究發現，化學伴侶4-苯基丁酸鈉(PBA)可以降低內質網應激水平，從而減少心肌細胞的凋亡，縮小梗死面積并改善心功能[8]。通過抑制親環素D蛋白(cypD)也可減輕心臟I/R中過度的內質網應激水平，減少線粒體通透性轉化孔的開放，起到減輕I/R損傷的作用[9]。此外，在內皮細胞缺氧/復氧實驗中，同樣發生著過度的內質網應激，GRP78、磷酸化Caspase12、CHOP的表達均增加，細胞發生過度凋亡，而乙酰膽堿可通過3型毒蕈堿乙酰膽堿受體(M3AchR)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路，抑制內質網應激相關的凋亡通路，還可保護內質網超微結構，從而發揮積極作用[10]。

可見，抑制過度的內質網應激對心肌梗死的治療有益。近年來，大量研究證實中藥的作用機制也與減輕過度的內質網應激密切相關。柚皮素可通過參與內質網應激的3條經典信號通路，改善I/R中過度的內質網應激和細胞凋亡[11]。紅景天苷可通過作用于PERK和IRE1通路，抑制過度的內質網應激，從而減輕大鼠胚胎心肌細胞H9C2的缺氧/復氧損傷[12]。黃芪甲苷可作用于GRP78、葡萄糖調節蛋白94(glucose regulated protein 94，GRP94)、IRE1，抑制內質網應激，阻止線粒體通透性轉化孔的開放[13-14]。而番茄紅素可減少內質網應激相關蛋白GRP78、ATF-6、剪接型XBP-1、elF2α、磷酸化elF2α和凋亡相關蛋白CHOP、Bcl-2相關的X蛋白(Bax)、Caspase-12及半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達而發揮對心肌細胞的保護作用[15-16]。

2.2 糖尿病性心臟病 糖尿病性心臟病是導致糖尿病病人發生心力衰竭和死亡的重要原因，臨床上以心室肌的擴張與肥厚，同時伴隨左室舒張及收縮功能障礙為特點，而內質網應激在糖尿病性心臟病發生發展過程中發揮著重要的作用。研究發現，高血糖介導的氧化應激會影響內質網伴侶蛋白的催化功能，如蛋白二硫鍵異構酶(PDI)、蛋白二硫化物異構酶A3(ERp57)和葡萄糖調節蛋白94(GRP94)[17]，這些伴侶蛋白可以導致錯誤折疊蛋白的積累，從而激活UPR傳感器，恢復內質網的正常功能[18]。然而，在短暫的自適應后，往往會發生過度的內質網應激，抑制過度的應激可減輕糖尿病性心臟病心肌損傷。研究表明，促紅細胞生成素通過抑制糖尿病性心臟病過度的內質網應激，減輕大鼠心臟功能障礙[19]。鈉-葡萄糖共轉運體2抑制劑Empagliflozin抑制內質網應激，減少GRP78、CHOP、Caspase-12、XBP-1、激活轉錄因子-4(ATF-4)和腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)的表達，從而改善糖尿病性心臟病[20]。也有研究表明，基因CNR1缺失會促進AMPKα激活，減少應激相關蛋白PERK、ATF-4、ATF-6和eLF2α的表達，改善內質網應激和胰島素抵抗，預防代謝應激誘導的心臟損傷[21]。

糖尿病性心臟病病人常會發生心肌重構，進而加重病情，抑制內質網應激可以改善心肌重構和心臟收縮功能障礙。如敲除rac1基因可阻斷高糖誘導的內質網應激，減少應激相關蛋白GRP78、磷酸化PERK(p-PERK)等的表達，減輕心肌重構[22]。心肌組織重構包括心肌實質和間質的重塑，而心肌實質重塑是指心肌細胞肥大、壞死和凋亡。研究發現，糖尿病性心臟病會導致內質網應激相關分子PERK、IRE1、ATF-6的過度激活，而阻斷內質網應激的PERK信號通路可減輕Ros介導的糖尿病心肌細胞凋亡[23]。抑制過度的內質網應激同樣是許多中藥提取物的潛在作用靶點。如人參素Ginsenosiderg1通過抑制內質網應激誘導的細胞凋亡，起到改善糖尿病性心臟病的作用[24]；其他如黃芪多糖、桑白皮提取物也可通過調節內質網應激而減輕糖尿病心肌損傷[25-26]。也有研究表明，苦參堿通過影響ATF-6信號通路減輕糖尿病性心臟病心肌纖維化，進而改善心功能[27]。

2.3 肥厚性心肌病 內質網應激參與肥厚性心肌病的發生發展過程。研究發現，心肌組織中Myozap蛋白可通過SRF信號通路過表達，使心肌細胞的蛋白聚集增加，引發UPR、自噬和凋亡，導致心肌病的發生[28]。在心肌病的進展階段，心肌細胞肥大是肥厚性心肌病的關鍵病理機制之一，內質網應激參與其中。脂肪素(Apelin)是G蛋白結合受體APJ的內源性配體，研究表明，Apelin-13可導致活性氧的產生和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4的表達增加，從而導致心肌細胞肥大。此外，Apelin-13處理可劑量依賴性地增加細胞中兩種內質網應激標志物GRP78和CHOP的表達，而用NADPH抑制劑可阻斷Apelin-13誘導的GRP78和CHOP表達增加。可見，內質網應激參與Apelin-13誘導NADPH導致心肌細胞肥大這一過程[29]。心肌纖維化是肥厚性心肌病的關鍵病理基礎，內質網應激同樣參與其中。研究發現，TXNDC5是一種新型的心肌纖維化介質，可通過轉化生長因子-β(TGF-β)-UPR-ATF-6軸調節纖維化，使心臟成纖維細胞活化，膠原蛋白合成增加等，而靶向TXNDC5是一種新的改善心肌纖維化，提高心功能的策略[30]。

心肌肥厚與過度的內質網應激有關，抑制過度的內質網應激改善心肌肥厚已在許多研究中得到了證實。如c1q-腫瘤壞死因子相關蛋白3(CTRP3)是一種脂肪因子，可通過抑制P38通路，減輕內質網應激，進而減輕肥厚和纖維化，恢復左室功能[31]。陸薇薇等[32]的研究也表明，降鈣素基因相關肽家族成員Intermedin1-53通過激活AMPK信號通路，顯著抑制內質網應激相關分子的表達及減少凋亡，從而改善心肌肥厚。

近年來，研究發現，一些中藥提取物也可通過抑制內質網應激來達到改善肥厚性心臟病的作用。小檗堿通過抑制壓力負荷所致的內質網應激，減少相關蛋白GRP78和CHOP的表達，顯著改善心肌肥厚及心功能紊亂，抑制心肌細胞凋亡，對肥厚型心肌起保護作用[33]。也有研究表明，白藜蘆醇通過下調內質網應激相關因子GRP78、CHOP和Bax的表達，上調Bcl-2的表達，發揮改善心肌肥大的作用[34]。

2.4 心力衰竭 心力衰竭是多種心腦血管疾病發展的終末階段，病死率高，病理機制復雜。而由內質網、泛素蛋白酶體系統、自噬溶酶體系統構成的質量控制系統失調，對于心力衰竭來說，是一種新的病因機制[35]。內質網的質量控制機制UPR，依賴于分子伴侶，會區別對待錯誤折疊的蛋白質，確保了蛋白的正常生產和處理。適度的內質網應激對心力衰竭是有益的。研究發現，Pak2是一種定位于心肌細胞內質網膜附近的應激反應性激酶。在應激或壓力過載作用下，Pak2缺失小鼠的心臟表現為內質網反應缺陷，心功能障礙，而調節Pak2可以促進保護性的內質網應激。進一步研究發現，Pak2主要通過IRE1/XBP-1途徑增強內質網功能，改善心臟功能，減少凋亡，從而對心力衰竭起改善作用[36]。

內質網應激在不同的細胞環境或不同的疾病進展階段發揮截然相反的作用，而在心力衰竭這一疾病中，非可控的嚴重的內質網應激被激活。GRP78在心力衰竭病人中被發現表達增加，提示在心力衰竭中UPR激活。此外，心力衰竭病人表現出內質網結構改變以及參與UPR反應的內質網蛋白的失調，如GRP78、ATF-6、XBP-1[37]。相關研究也表明，通過抑制內質網應激IRE1的激活和XBP-1的剪接，膽汁酸結合牛脫氧膽酸(TUDCA)抑制UPR，在鈣網蛋白過表達引起的心力衰竭模型中可降低心肌纖維化[38]。另外，在大鼠心力衰竭模型中，通過調節內質網應激標志物如Caspase12、CHOP和GRP78被認為是阿托伐他汀保護心臟免受心力衰竭的機制之一[39]。

在心力衰竭中，過度的內質網應激也會導致心肌電重構，心肌細胞間離子通道平衡失調導致心肌電信號紊亂，引發各種類型心律失常，威脅病人生命。研究發現，過度激活的UPR通過下調主要的心臟離子電流，導致心肌細胞發生電重構。首先，PERK和IRE1都下調了心肌特異性鈉通道SCN5a(Nav1.5)、鉀通道hERG和KvLQT1。其次，PERK專門下調電壓門控性鉀通道4.3亞型Kv4.3，而IRE1分支下調L型電壓門控性鈣離子通道Cav1.2。可見，UPR作用于離子通道參與電重構，而靶向UPR減輕電重構可以治療心律失常，改善心力衰竭病人的預后[40]。在心力衰竭的治療方面，中醫藥的作用機制也與內質網應激有關。已有研究發現，復方真武湯可降低GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達，改善心力衰竭大鼠心室重構，減少心肌細胞凋亡和心肌纖維化，治療心力衰竭[41]。

3 小 結

內質網是生物體重要的細胞器，其憑借龐大的膜結構而成為協調信號轉導的平臺，在蛋白質合成與加工、脂質合成、鈣動態平衡等方面均發揮重要作用。各種原因導致未折疊蛋白蓄積或鈣穩態的失衡均可引起內質網應激。初期以激活保護信號通路促進細胞功能恢復為主，但程度過強或時間過長則誘導凋亡啟動因子的表達，導致凋亡事件的發生。內質網應激在心肌梗死、糖尿病性心肌病、心肌肥厚、心力衰竭等多種心血管疾病中的雙向作用，對于這些疾病的發生、發展、預后均起至關重要的作用。在病理生理條件下，UPR信號分子也可與其他信號通路相互作用，包括氧化應激、自噬、炎癥等。因此，靶向UPR信號通路的藥物有望成為治療這些心血管疾病提供新的思路。近年已有研究提示中醫藥治療心血管疾病的作用機制與內質網應激有關。可以預見深入研究中醫藥對內質網應激的調節機制，對于心血管疾病的防治具有積極意義。