蛋白質結構解析技術研究現狀與方向

徐顥溪劉 磊

（1.中國科學技術大學，安徽 合肥230026；2.安徽職業技術學院，安徽 合肥230011）

蛋白質是生物的生命進程中的主要功能性大分子物質，結構生物學即利用蛋白質分子空間結構的解析來分析蛋白質生物學功能，并進一步研究生物體生命活動分子機制[1]。故解析蛋白質分子結構是日前較為熱門的研究方向。現階段對蛋白質分子空間結構的解析方法主要有較為傳統的核磁共振技術（nuclear magnetic resonance）、X射線晶體衍射法（Xray crystalline diffraction）以及近期研究較多的冷凍電鏡技術（Cryo-Electron Microscopy）[2]等。

一、X射線晶體衍射法

自從1895年倫琴發現X射線后，物理學家們就開始探索X射線的特性及其應用方向[3]。在1934年，貝爾納和克勞福特得到了第一張蛋白質（胃蛋白酶）晶體的X射線衍射圖片。1953年，蛋白質晶體學家佩魯茨通過將重金屬粒子引入蛋白晶體里，進行同晶置換來解決蛋白晶體X射線衍射相位問題，提出了蛋白質晶體分子結構可測定型的理論基礎，并進行了低分辨率的蛋白晶體衍射解構[4]。歷史上，用X射線晶體衍射法第一個測定蛋白質大分子結構并對其分子結構進行解釋的是布萊克和菲利普斯，他們分別測出了溶菌酶的三維空間結構并解釋了其分子作用機理[5]。后期，X射線大多由同步輻射光源產生。

X射線衍射法測定蛋白質空間結構時，需要先對目標蛋白進行純化及結晶。解析蛋白晶體結構所涉及的X射線波長約為1A?，這是因為蛋白晶體結構中的分子均為規律性分布，且晶體內原子間的距離與此波長范圍的數量級相同[6]。當光打到蛋白晶體上，蛋白晶體內每個原子都產生次生射線相互疊加且干涉，且形成強X射線衍射成像。其晶體衍射狀況和晶體自身結構相關，具備強烈的規律性及特征性。其衍射強度與單位晶胞中的重金屬原子排列周期及方式等特性相關，衍射的方向和單位晶胞的大小及形狀等相關[7]。人們利用晶體中衍射位點的間距及排列分析蛋白晶體結構的排列規律及方式，并通過計算機輔助計算，利用衍射強度的不同，分析蛋白空間結構中單個原子的坐標位點[8]，以此解構蛋白晶體。

二、核磁共振技術

核磁共振包括固相和液相技術，其最大特點是液相核磁共振技術。固相核磁共振技術主要用于不可溶蛋白結構，而液相核磁共振技術的應用更為廣闊，它可以在液相環境中，在各類如溫度、離子濃度及pH值等因素接近生理條件情況下，對蛋白進行解構。1978年，核磁共振技術首次被用于蛋白質結構的解析，獲得首個高分辨率病毒衣殼蛋白三維結構（西紅柿叢矮病毒）[9]；在2008年，利用固體核磁共振技術輔助電子顯微鏡，科學家獲得了β片層結構的淀粉樣纖維蛋白的完整結構，此蛋白與阿爾茨海默病關聯緊密，有助于人們對此病癥分子機理及診療手段的研究[10]；核磁共振技術中取得重要進展領域之一是通過核磁共振技術無損獲得細胞中分子結構信息，2009年，有研究顯示,核磁共振技術展示了泛素在細胞內外質子交換速率之差，以及細胞中蛋白FKBP12與免疫抑制劑相互作用方式[11]，令人類社會進一步了解了分子及原子水平中生物大分子功能，以及蛋白質結構和功能的關系。

在應用液相核磁共振技術對蛋白結構進行研究的過程中，首先需要通過同位素對蛋白樣品進行標記，主要是在培養基中利用15N對氮源標記、利用13C對碳源標記，用同位素標記的碳源或氮源為唯一碳素或氮素的來源。通過核磁共振技術處理后，需要指認核磁共振譜圖上的化學位移，即得到蛋白結構中可形成核磁共振記號的每個原子化學位移的數值。包括主鏈上及側鏈上每個原子的化學位移。化學位移指認可通過主鏈試驗HNCA、HN（CO）CA等或側鏈特殊實驗（HB）CB（CGCD）HD等確認[12]。正確選擇原始結構是后續步驟的重要基礎，通過一些自動化軟件，如CYANA中的CANDID軟件包，或ARIA等[13]，確認NOE約束歸屬而獲得粗糙的蛋白原始折疊空間構像。在此基礎上，繼續研究，獲得其結構約束，進一步通過如ANSO、SANE、Xplor-NIH或CYANA等軟件計算結構，結構確認后最后通過如AMBER、CHARMM以及INSIGHT等模擬分子動力學的軟件進行蛋白結構的精修。

三、冷凍電鏡技術

冷凍電鏡技術，即冷凍電子顯微鏡技術[14]，通過將樣品迅速冷凍固定于玻璃態不定型溶液里，用透射電鏡在低溫條件下顯像，再通過圖形處理及后期計算解析樣品空間結構。此法具有樣品無須結晶、可研究的生物分子跨度達到12個量級、所需樣品量少、樣品分辨率已至（近）原子水平等優點，突破了研究生物大分子的各類難題。近幾年，冷凍電鏡技術的長足發展一是來自硬件的更新——DDD（Direct electron detector，自接電子檢測相機）的出現，DDD具備高分辨的成像裝備，能直接檢測電子[15]；二是來源于圖形圖像處理軟件的進步，可分辨較低分子量的小分子蛋白和細胞器，并可對于樣品漂浮而產生的偏差進行糾正。

冷凍電鏡技術包括了樣品分離純化、電鏡樣品的制備、蛋白數據搜集及處理等步驟。冷凍電鏡中所需樣品純度需為90%至95%以上，對于純化較困難的蛋白樣品，后期可進行軟件數據模擬純化以區別不同狀態樣品。制備電鏡樣品時，通過液氮冷卻的乙烷將含水樣品速凍，將水分子轉為玻璃態非晶體冰，樣品懸浮于其中，用于減少電子輻射，保持其天然構像[16]。然后通過電鏡進行數據的收集，數據的收集量來源于被測蛋白樣品的均一性、分辨率、對稱性及成像質量等，對于均一性差、分辨率差以及不對稱分子通常需要采集大量粒子數據，約收集5到15萬個數據才可達到近原子分辨率。粒子數據收集后需要進行進一步的處理，首先要先確定粒子的參數，每個粒子圖需確定5類參數，分別為平移的自由度X和Y（兩個平面中）、旋轉的自由度α及β（兩個離開平面中）和γ（一個平面中）[17]，其中從旋轉的自由度獲得了粒子空間三維數據，利用對位可消除一個平面中的自由度，可通過重構軟件SPIDER、XMIPP及EMAN2等的計算用以確認每個粒子相關參數。然后，根據K均值聚類等算法進行二維分類，用以估算粒子分布及取向、粒子數據質量等，二維分類后通過中心截面原理利用共價線、RCT等方法重構樣品的空間三維結構，而后進行三維分類和模型的精修。三維分類可確認不同粒子的空間取向、空間構像及組成和結構等，而獲取高分辨率空間結構，常用FREALIGN和RELION軟件[18]。對模型進行精修時，可利用投影匹配的方法進行比對，最終大幅度提高物質空間結構的分辨率。最后通過FSC曲線對分子結構的分辨率進行評估，通常分辨率在15A?以上，可分辨蛋白亞基的分界線；分辨率在10A?以上可辨認二級結構密度；分辨率在4A?以上可分辨蛋白主鏈；當分辨率在3A?左右，即可辨別氨基酸殘基側鏈基團等[19]。

四、未來方向發展

蛋白結構解析技術對于蛋白分子的結構、生物學功能及其生理特性的了解和應用具有重要的意義[20]。近年來，多種蛋白結構解析技術的并行發展，同樣對結構生物學的發展發揮了重要的作用。

X射線晶體衍射法較為主流和經典，2009年世界上第一臺X射線自由電子激光裝置建成[21]，自由電子激光形成的射線是具備短時間高強度的脈沖，對不能結晶的蛋白結構、超小晶體以及受損晶體可獲得衍射成像，使人們對生物大分子結構通過X射線衍射法的解析方式有了另一種不同且全新的理解，在RCSB Protein Data Bank中通過X射線晶體衍射法解析的蛋白結構占比約88%。但依賴于大分子晶體的制備，對于許多無法結晶的物質存在著結構的難度。利用同步輻射光源解析的主要是靜態或者微動態蛋白晶體結構，利用X射線自由電子激光解析的則是ps甚至fs量級的蛋白動態空間構型[22]，被認為有可能為生物大分子解構方式帶來大跨步的躍進。

核磁共振技術可獲得蛋白的靜態和動態結構，在20世紀末期，只有相對分子質量較小（＜25k）的蛋白空間結構可通過核磁共振技術解構[23]。后因核磁共振設備的不斷更新，以及新的核磁脈沖和蛋白標定技術的發現，核磁共振技術以及可以解構的蛋白已遠大于25k，甚至可解構超大蛋白，如分子量大小為幾十萬的蛋白空間結構。不光如此，液體核磁共振技術更大的優越性表現在可解構蛋白分子在溶液環境中的動態結構，它可利用核磁弛豫現象研究原子水平下的多位點的蛋白動力學性質。在生物體中，蛋白大多具備功能性，故靜態空間結構的解構往往不能完全反映蛋白功能性，故蛋白動態結構的解析是對于蛋白生物學活性研究的關鍵一環。近些年核磁共振技術發展到可研究更高分子量的蛋白大分子的動態結構，如選擇性標記或氘代樣品制備[24]，可獲得更多長程約束，提高解構質量，如TROSY（Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，橫弛豫優化脈沖）的出現，可指認化學位移及解析解構[25]。但多測定的為分子量較小的大分子類物質，可解析的蛋白結構有限。故核磁共振技術，特別是液相技術可研究蛋白動態結構、功能及其動力學特性，有其獨到之處，雖然如此，但由很多實驗技術還不夠成熟，不具備普適性，還需要繼續分析和改進。

最近發展迅猛的冷凍電鏡技術，可測定非晶體生物大分子類物資，通過冷凍電鏡技術可利用其高分辨率能觀察到小分子物質、解析小分子蛋白以及不對稱樣品等[26]。冷凍電鏡對蛋白質結構解析技術的發展在醫學領域做出重要貢獻。20世紀末，因冷凍電鏡對生物對稱性樣品特有的高度解析性，張景強得到了分辨率僅為0.8nm的家蠶質多角體病毒，在病毒蛋白結構研究及針對病毒致病機制對應藥物研制方面功不可沒[27]；清華大學研究團隊在2016年第一次利用冷凍電鏡獲取了線粒體中呼吸鏈超級復合蛋白空間結構，指明了以其為靶向物質藥物的研究方向[28]；中國科學院生物物理研究所李國紅和朱平研究組合作獲得了30nm染色質左手雙螺旋高分辨率三維結構[29]，有助人類對癌癥等病癥分子機制研究，并為人類基因組計劃做出了重要貢獻。同時冷凍電鏡技術伴隨著人類社會對生命科學領域研究的重視而逐漸發展起來，清華大學王宏偉研究組于2017年首次提出且利用冷凍電鏡成像理論新方法過焦成像技術得到高分辨蛋白質空間結構[30]。2018年浙江大學冷凍電鏡中心首次解析了蛋白質原子分辨率結構[31]，2020年，德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所研究團隊和英國劍橋大學研究團隊利用冷凍電鏡技術分別解析了至今為止最為清晰的原子級分辨率的蛋白質結構，并首次識別出蛋白分子中單個原子位置[32]。冷凍電鏡技術及方法已逐漸成熟，迅猛發展，但對晶體類蛋白的應用場景卻有所不足。

總之，各類蛋白解析技術有其優點，也有其缺點。在后續研究發展中，需將多種結構解析技術結合而有利于各類難以解構的蛋白之謎被解析，并進行更深層次的探討及蛋白性質及功能的應用。