蛋白組學在糖尿病腎病診斷及預測價值中的應用

魏靜，李海霞，哈小琴

·綜述·

蛋白組學在糖尿病腎病診斷及預測價值中的應用

魏靜，李海霞，哈小琴

730030 蘭州，甘肅中醫藥大學臨床醫學院（魏靜、哈小琴）；730050 蘭州，中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院檢驗科（魏靜、李海霞）；730000 蘭州大學公共衛生學院（李海霞）

據統計，有 30% ~ 40% 的 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者會發展成為腎病（diabetic nephropathy，DN），其中有一半 DN 患者會發展為終末期腎臟疾病，需要進行透析或移植治療[1]。DN 分為三個階段：微量白蛋白尿、臨床糖尿病腎病和終末期腎損害。微量白蛋白尿可用于糖尿病腎臟損害的早期檢測，在初期腎病階段進行干預可有效防止進展為終末期腎損害。但是當患者體內出現微量白蛋白尿時，腎臟組織已經發生了一些結構破壞。此外，許多晚期腎臟組織病理學改變的患者顯示正常白蛋白尿[2]。蛋白組學是對特定組織、不同細胞或機體體液中表達的蛋白質的整體研究。通過找到健康受試者與具特定病理改變患者之間的差異蛋白點，可用于識別疾病的特定診斷或預后生物標志物[3]。本文就通過蛋白組學技術在 DN 中診斷、預測等方面的作用作一綜述。

1 蛋白組學

蛋白組學即對生物樣品中表達的蛋白質進行總體分析，更深入地研究包括檢測蛋白質的翻譯后修飾、蛋白質-蛋白質相互作用等。質譜法通常與前期色譜分離技術，如液相色譜（liquid chromatography，LC）和毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）相結合，是研究蛋白組學的主要工具[4]。蛋白組學技術包括雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、表面增強激光解吸/電離、液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和毛細管電泳-質譜（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）等[5]。蛋白組學不僅被廣泛用于發現新的生物標志物，而且還可以更好地了解疾病（例如糖尿病、癌癥、阿爾茨海默病和腎臟疾病）的潛在機制，因為該技術能夠檢測識別細胞和生物樣品中的蛋白質表達水平[6]。由于生物樣本中蛋白質之間的生化特性和穩定性有所不同，蛋白組學的研究面臨著多重挑戰，例如蛋白質的濃度范圍很寬，蛋白組學檢測技術取決于樣品的制備、蛋白質的初始分離，難以量化低豐度的尿標志物及個體之間尿蛋白排泄的巨大差異[7]。盡管蛋白組學的發展存在一定的挑戰，但其對于疾病的診斷、預后及治療靶點的研究仍然具有重要價值。

2 尿蛋白組學在糖尿病腎病中的應用

尋找早期糖尿病腎病的標記物成為目前的研究熱點。對于腎臟疾病的研究，尿蛋白組學已得到迅速發展并廣泛應用于腎臟損害的早期診斷和鑒別，具有無創、簡便、可大量獲取的優點[8]。與其他生物液體相比，尿液中包含從全身到局部組織的細胞外囊泡、蛋白質和小分子物質。然而，高豐度蛋白（如白蛋白，占總蛋白量的 25%）仍是尿蛋白組學研究的障礙，因為它可能掩蓋了低豐度的蛋白質[9]。同時，尿液也是直接反映腎臟的非侵入性物質。因此，尿蛋白組學的研究對于腎臟疾病具有重要的意義[10]。

等壓標記進行相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）不僅對鑒定蛋白的數量和種類有優勢，而且組織、細胞、體液等均可作為檢測樣本，便于探索疾病發生機制和篩選標志物。有研究通過使用 iTRAQ 及無標記蛋白組學，以鑒定與腎病相關的潛在尿蛋白標記物并通過酶聯免疫吸附測定進行交叉驗證。總共通過 iTRAQ 和無標記蛋白組學分析分別鑒定出 341 和 396 種蛋白質，發現觸珠蛋白（haptoglobin，HPT）可以作為腎病相關的候選生物標志物，用于區分健康個體和腎病患者以及糖尿病患者的標志物，具有最高的識別能力。因此，HPT 與肌酐之比（HPT-to-creatinine ratio，HCR）被評估為早期腎功能下降（early renal functional decline，ERFD）的獨立預測因子。這些數據表明，HCR 可能是比尿微量白蛋白更敏感的生物標志物，可以用作腎功能下降的早期檢測指標，同時也是臺灣糖尿病患者中與 ERFD 相關的標志物[11]。

動力蛋白在 DN 的發生及發展過程中起到重要作用。它可通過促使線粒體的分裂、加劇氧化損傷和細胞凋亡，造成腎小管上皮細胞受損。另一方面，動力蛋白還可以引起足細胞的損傷。有研究發現采用蛋白組學 2-DE 和質譜技術發現動力蛋白在氣陰兩虛證中高表達、肝腎陰虛證中低表達、在脾腎陽虛證中不表達，表明氧化應激損傷在氣陰兩虛證中較為明顯[12]。

Lindhardt 等[13]通過 CE-MS 在慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）患者尿樣中發現了尿液生物標記物，稱為 CKD273 分類器，并在幾個 CKD 隊列中得到驗證。Schanstra 等[14]對 T2DM 患者進行隨訪，主要考察患者從正常蛋白尿到微量蛋白尿以及到大量蛋白尿的改變。研究發現 CKD273 分類器對預測 DN 進展比蛋白尿和 eGFR 的水平更具價值。

Betz 等[15]通過慢性高血糖和高血壓腎損害大鼠模型來模擬 DN，通過尿蛋白組學分析發現，DN 大鼠尿液中有 297 種多肽表達增加、15 個多肽表達減少。研究發現大鼠尿表皮生長因子（urinary epidermal growth factor，uEGF）表達較對照組少。同時，在腎功能正常的 T2DM 患者中研究發現，uEGF 與肌酐比值的降低和正常量蛋白尿 T2DM 患者腎功能的下降密切相關，提示 uEGF 與肌酐比值可能是預測 DN 發生的新型尿液標志物。

3 血漿及血清蛋白組學在糖尿病腎病中的應用

除了尿液外，血漿也被廣泛應用于研究各種疾病的生物標志物[16]。然而，血液中的蛋白組學由于采樣后的可變性而難以檢測，并且許多高豐度的蛋白質，例如免疫球蛋白、白蛋白可以掩蓋低豐度的潛在生物標記物。因此，早期的血漿蛋白組學研究并未顯示出探討生物標志物的能力，因為循環肽可能反映的不僅僅局限于腎臟的一般病變過程。但是，蛋白組學的進步正在推動這一領域的發展[17]。

有研究首次使用蛋白組學 iTRAQ 技術通過 Q-Exactive質譜儀鑒定早期糖尿病腎病中差異表達的血漿蛋白；結果發現，與對照組相比，實驗組共鑒定出 57 種蛋白質，其中上調 32 種、下調 25 種。同時，通過 ROC 分析和蛋白印跡技術證實了明膠蛋白、膠凝素-11、PTPRJ 和 AKAP-7 蛋白是早期糖尿病腎病的候選生物標志物[18]。

國內學者通過應用血清蛋白組學技術篩選 III ~ IV 期 DN 患者氣陰兩虛證的差異蛋白，研究發現所鑒定出的差異蛋白質質核比大多在 1000 ~ 20000 Da 的肽段內，從而為臨床應用 DN 氣陰兩虛證的研究提供客觀參考依據，從中醫的角度為 DN 的研究提供新的思路[19]。

4 組織蛋白組學

組織蛋白組學的研究對病理生理的研究具有重要意義。在臨床中腎活檢并不作為 DN 患者的常規檢查，而且經活檢分離的腎小球數量少，因此腎組織蛋白組學研究少有報道。人體腎臟組織不容易獲得，目前組織蛋白組學的研究在動物模型中應用較多。

衰老標志物蛋白-30（senescence marker protein-30，SMP-30）是一種多功能蛋白，與細胞穩態、抗壞血酸的生物合成和氧化應激調節有關，同時也與 β 細胞功能有關。此外，SMP-30 的缺乏會影響胰島素分泌[20]。有研究通過二維差異凝膠電泳（2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）和質譜對早期 DN 大鼠模型的腎組織蛋白組學進行了差異分析，發現與健康對照組相比，DN 組 SMP-30 在腎組織中的表達明顯下調，對照組和 DN 大鼠尿中分離的外泌體也有相同的趨勢，并在人體中得到驗證。表明 SMP-30 對于 DN 的診斷具有重要價值[21]。

5 腎小球蛋白組學

DN 由多種因素導致，包括葡萄糖代謝紊亂、氧化應激、腎血液動力學的改變和遺傳傾向等。為了更全面地了解 DN 的發病機制，現已將各種蛋白組學應用于病理生理研究。通過使用 2D-DIGE 和基質輔助激光解吸/電離飛行時間（MALDI-TOF）質譜分析，觀察了早期 DN 腎小球蛋白的變化。研究發現在 KKAy 小鼠和 C57BL/6 小鼠之間獲得了 19 種差異表達的腎小球蛋白。KKAy 小鼠中有 17 種上調，有 2 種下調，其中包括抑制素和膜聯蛋白 A2 的上調。抑制素可能與膜聯蛋白 A2 相互作用并受 Ca2+依賴性方式的調節[22]。有研究認為抑制素可能是治療與氧化應激增加和線粒體功能障礙有關的疾病的潛在治療靶點，例如胰島素抵抗、T2DM、肥胖癥和癌癥等[23]。因此，對抑制素和膜聯蛋白 A2 的進一步研究可能會為 DN 的發病機制提供新的見解。從長遠來看，來自單個腎小球的綜合數據可以用來精確定位腎臟疾病動物模型或蛋白尿和腎小球疾病患者的新靶點。

有研究對有較長的糖尿病病史卻不出現 DN 的患者和 DN 患者的腎小球進行蛋白組學分析，結果發現沒有發展為 DN 患者腎小球中丙酮酸激酶 M2 的表達和活性上調。丙酮酸激酶 M2 激活可以通過增加葡萄糖代謝流出，抑制毒性葡萄糖代謝產物的產生以及誘導線粒體生物合成以恢復線粒體功能從而保護腎臟[24]。

6 小結與展望

目前 DN 尿液蛋白組學研究已有所收獲，發現了一些對于 DN 鑒定具有潛在臨床診斷價值的標志物，如觸珠蛋白、動力蛋白及 uEGF 等蛋白。蛋白組學研究仍然處于初級階段，雖然蛋白組學已經在尋找早期 DN 標志物方面取得一些成就，但幾乎所有研究結果均處于基礎研究階段，還沒有完全應用到臨床，同時目前還沒有出現一個可以代替尿白蛋白排泄率的尿蛋白組學的生物標志物。然而，隨著蛋白組學技術和生物信息學的不斷發展，未來我們很可能通過分析尿液、血清、腎組織的蛋白組學變化獲得足夠的生物信息，通過生物信息學技術建立 DN 蛋白質組數據庫，從而進一步探討 DM 患者發生腎損害的機制、篩選特異的診斷標志物等，給出針對性的預防和治療方案。同時未來的研究應側重于結合基因組、轉錄組、表觀遺傳學組和代謝組學的系統生物學研究，有望為 DN 患者的早期診斷、早期干預和精準治療帶來新依據和新策略。

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國家自然基金（81273568）

哈小琴，Email：haxiaoqin2013@163.com

2020-02-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.017