多發性骨髓瘤殘留監測的方法學進展

胡建娥，孫秋艷，李良瓊，唐燕

重慶三峽中心醫院檢驗科1、藥學部2，重慶 404000

多發性骨髓瘤(MM)是一種惡性疾病，其特征是骨髓或髓外(很少見)出現克隆增殖的異常漿細胞(PC)，產生單克隆免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD、IgE免疫球蛋白)和/或單克隆免疫球蛋白輕鏈(κ/λ)。近年來，多發性骨髓瘤的治療方法迅速發展[1-3]。使用某些藥物，如沙利度胺、萊利多胺進行高劑量化療(HDCT)后，然后進行自體造血干細胞移植，使多發性骨髓瘤患者能夠實現相當高的總體生存率(OS)。靶向治療以及自體造血干細胞移植(AUTO-HSCT)促進了多中心國際臨床研究。新型藥物的治療增加了完全緩解率(CR)，然而在高危和難治性的多發性骨髓瘤患者中，雖然有超過30%的MM病例達到CR，但是其中大多數患者都有復發。CR，甚至是嚴格意義的完全緩解(sCR)并不足以識別患者群體對治療的良好反應和疾病進展的低風險。因此有必要對使用高敏感度和高特異性的方法對緩解程度進行更深層次的評價。AS-PCR和多色流式細胞術(MFC)是能夠最大限度的識別出在治療結束后仍存在的惡性漿細胞的主要方法。2011年，IMWG基于用AS-PCR和MFC檢測異常殘留漿細胞的優勢，增加了免疫表型和分子緩解的條件[4]。本文對檢測和評估多發性骨髓瘤緩解的傳統方法以及新近出現的方法學做一簡要的綜述。

1 骨髓形態學

骨髓細胞形態學是目前最廣泛的評估腫瘤負荷的方法。CR的標準是骨髓涂片中的漿細胞＜5%。但是形態學研究應與免疫學檢查相結合[5]。CHEE等[6]的一項研究表明，僅單克隆輕鏈(FLC)檢測不足以確定CR，10%的FLC比率正常的患者在BM涂片中存在＞5%的漿細胞。在一組92例免疫化學檢測結果陰性的患者中，13例患者(14%)在骨髓涂片中漿細胞大于5%，而這些患者的總生存率低于＜5%漿細胞的患者(分別為5.7年和7.9年)。通過骨髓細胞形態學計數漿細胞的比例，不能很好的評估患者的預后及復發。

2 血清和尿液的免疫學檢測

通過電泳和免疫固定電泳法定量測定血清和尿液中的M-蛋白和FLC(游離單克隆輕鏈)，用于診斷和監測MM的治療反應。血清游離單克隆輕鏈(FLC)定量已成為常規檢測。FLC比率是MM的一個獨立的預后因子，并且能評估疾病的進展[7]。然而，使用FLC定量評估MRD并不能有效地劃分不同的風險群體。根據MARTINEZ-LOPEZ等[8]的研究，在94例CR患者中，69例患者(73%)達到了sCR，但在CR和sCR組中，疾病的進展時間(CR和sCR的平均進展時間分別為53和62個月)沒有明顯的差異。在由LOPEZ-ANGLADA等[9]進行的130例患者的研究中獲得了類似的數據。PAIVA等[10]的研究表明，根據GEM 05＞65歲的治療方案，在260例接受治療的MM患者中，43%達到CR，30%達到sCR，30%達到免疫化學特異性緩解(IR)。然而，在CR和sCR患者中，生存率沒有明顯的差異；與CR和sCR患者相比，IR患者表現出了較長的無復發生存期(RFS)。此外，一些CR患者保留了陽性的免疫固定電泳檢測結果，但在這些患者中沒有發現M蛋白。在MRD陽性患者中，其免疫固定電泳檢測結果陰性，達到了IR，但在這些患者中，隨后又檢測到M-蛋白(中位數為3個月)。在sCR患者中觀察到類似的情況，在誘導治療后13個月表現出疾病進展[11]。

3 細胞遺傳學檢測

有研究顯示，影響多發性骨髓瘤進展期和OS最重要的獨立參數是FISH檢測細胞遺傳畸變、IR及年齡(60歲以下或以上)[11]。發病時檢測到的染色體缺陷決定了MM的風險。用FISH方法預測疾病所需的基本組套包括染色體易位t(4；14)(p16；q32)(出現頻率：13%)、t(14；16)(q32；q23)(出現頻率：3%)和染色體缺失del17p13(出現頻率：12%)。除此之外還可包括t(11；14)(q13；32)(出現頻率：15%)、13q缺失(出現頻率：46%)、1號染色體的異常，如1q重復(出現頻率：38%)[12]。高危的多發性骨髓瘤包括t(4；14)、t(14；16)或del(17p)[13]。微小殘留病診斷(MRD)基于FISH檢測有一定的局限性，一方面由于治療后殘余漿細胞數量少，另一方面FISH方法的靈敏度不足(10-2～10-3)，只高于形態學檢查(10-1)一個數量級。

4 Allele-specific PCR

該方法是通過檢測免疫球蛋白基因可變區域的特異性重排來確定腫瘤漿細胞的克隆性。B細胞的正常成熟包括V、D和J片段的重排，這些片段的組合形成了復雜的Ig基因(IGH、IGκ和IGλ)，其編碼多個可變免疫球蛋白分子結構域。在V(D)J段連接的位點上隨機插入和缺失，引起每一個B細胞(包括癌細胞)獨特的可變區。在每個患者的骨髓瘤細胞中發現的連接區域被用作特定于腫瘤特異性的靶標，以設計特定于等位基因(或患者特異性)引物。自上世紀90年代以來，巢式PCR用于檢測克隆重組，隨之而來的是實時定量PCR技術。

AS-PCR的缺點包括技術困難和適用性有限(沒有適當的目的基因可以分析)。PUIG等[14]的研究顯示，AS-PCR只能在42%的多發性骨髓瘤病例中使用，而在SARASQUETE等[15]的研究中適用于75%的病例。然而，在SILVENNOINEN等[16]的研究中進行的一系列修飾之后，AS-PCR的適用于100%的病例。此外，分子方法沒有考慮遺傳異質性和克隆選擇，可能導致在疾病治療過程中一些亞克隆檢測不到[17-18]。然而，選擇更好的引物和探針[16]，或選擇除IgH-VDJ以外的靶點，如kappa缺失區[19]，可以提高ASO-PCR的特異性、敏感性和適用性。

5 下一代測序

下一代測序(NGS)是基于使用一套引物(而不是針對每一個患者)，它允許放大和測序給定樣本的免疫球蛋白基因的所有重組片段(≥105)。這個方法證明適用于超過90%的MM病例，其敏感性≤10-6。在MM初診時，檢測到Ig基因的克隆重組，其用于作為后面檢測MRD的靶標[21]。在MARTINEZ-LOPEZ等[21]的研究中，MRD患者(n=133)被分成三組：高水平組(≥10-3)、中等水平組(10-3～10-5)和低水平組(＜10-5)；結果顯示各組在進展時間上有很大差異(分別為27、48和80個月)。NGS定量檢測最小殘留病灶有一定的困難，尤其是在Ig基因的多克隆重組中，檢測到的克隆重排的比例取決于正常B細胞數量多少，其數量是變化的，并且與治療方式有關。NGS采用MM患者外周血評估MRD顯示出其優勢，這是一種無創的檢測方法[21-22]。

6 全身磁共振成像(MRI)和正電子發射/計算機斷層攝影(PET/CT)

由于多發性骨髓瘤存在髓外復發的可能，MRI和PET/CT的使用使得BM中MRD陰性的患者能夠全面的評估緩解狀態。GALTSEVA等[23]在2015-2016年進行的一項研究中發現，113例患者中，有4例BM中MRD陰性，但在血液中檢測到M蛋白，MRI檢測確認存在髓外軟組織漿細胞瘤。全身MRI是檢測脊椎骨的病變、提供完整的相關組織損傷程度和性質以及BM浸潤的性質(局限性、彌漫性等)的最敏感的非侵入性可視化方法。但是值得注意的是，無論患者對治療方案有無反應，在治療后的幾個月，都會觀察到局部病變持續存在，這與反應性的水腫或者殘留病變細胞的存在有關，導致血清學反應與MRI對緩解評估不一致。所以建議在治療后3個月進行MRI檢查[24]。PET/CT通過FDG的攝取評估髓外和髓內病變的細胞代謝，從而定位病變，并識別溶骨損傷[25]。事實證明，HDCT和/或AUTO-HSCT后，存在異常的FDG攝取細胞，提示預后不良[26]。有研究顯示，采用沙立度胺/地塞米松誘導治療，然后進行AUTO-HSCT，有63%的患者PET/CT顯示存在病變，這些患者顯示不好的預后；自體造血干細胞移植后3個月無異常FDG攝取的患者預后較好；CR患者中有23%顯示攝取FDG，這些患者生存期較短[27]。但是，PET/CT在感染或炎癥過程中可產生假陽性和假陰性[280]。對比全身MRI和PET/CT，表明PET/CT具有與MRI相似的敏感性，但特異性更強。

7 多色流式細胞

漿細胞是產生抗體終末期B細胞。盡管漿細胞幾乎可以在每個組織中產生，但大多數漿細胞是由抗原激活的B淋巴細胞通過多步驟轉化成熟而來的，從次級淋巴組織如淋巴結、脾臟和黏膜相關的淋巴組織開始產生[29]。這些組織中，新近產生的漿細胞通過外周血遷移，到達骨髓和其他外圍組織(如脾臟和胃腸黏膜)中存活下來，這些地方通常可以檢測到長期存活的漿細胞[30]。因此，早期的漿細胞可以在次級淋巴組織和外周血中檢測到，而終端分化的漿細胞通常出現在骨髓中[31]。骨髓漿細胞通常缺乏大多數泛B細胞標記的表達，如CD20、CD22和膜表面免疫球蛋白(SmIg)；此外，骨髓漿細胞顯示出異質性的CD19的表達，CD45low和CD56-/low、CD38和CD138高表達[32]。值得注意的是，盡管骨髓漿細胞的常見免疫表型如此，但是骨髓漿細胞是由幾個不同表型的細胞亞群組成，其顯示了與成熟相關的特征[33]。例如，大多數正常/反應的骨髓漿細胞表達CD19，但是其中有約三分之一的正常漿細胞CD19-；相似的是，盡管大多數CD19+、CD19-正常/反應性骨髓漿細胞CD45+CD56-CD81+，但是一小部分CD45-CD81-CD56+的是正常/反應性漿細胞，特別是CD19-骨髓漿細胞群中[34-35]。這些少量的小亞群的骨髓漿細胞的精確生理意義還有待進一步研究，有可能與不同的成熟度的漿細胞有關，隨著細胞成熟度的增加，細胞數量減少，例如，從主要CD19+CD56-細胞群到小的 CD19-CD56-和CD19-CD56+細胞群[36]。

骨髓瘤細胞的表型與正常的漿細胞不同。用于檢測骨髓瘤MRD相關的異常抗原表達標記包括CD19、CD56、CD45、CD38、CD27，以及較少的CD20、CD28、CD33、CD117和SmIg[37]。聯合檢測這些標記(或其中部分標記)和胞質免疫球蛋白(CyIg)κ/λ輕鏈可進一步確定可疑的克隆性漿細胞。近年來，新發現了一些骨髓瘤細胞的抗原標記，其中，CD81、CD200、CD54和CD307等已成為最為熟知的標記[38-39]。但是，骨髓瘤細胞出現每個異常標記的頻率變化很大[40-41]，除此之外，標記抗體所用的熒光素、抗體的克隆號及不同廠家生產的抗體都可能對骨髓瘤細胞表型產生影響。總而言之，不能采用單一的抗原表達異常來判斷正常漿細胞與腫瘤漿細胞。確定正常與腫瘤漿細胞，需要采用多種抗體標記共同判定。例如，CD19在腫瘤性漿細胞上是不表達的，但是MM-MRD時CD19可以表達在腫瘤漿細胞上[42]，也有大約30%的病例，反應性/正常漿細胞不表達CD19[43]，相似的，CD56被認為表達在骨髓瘤細胞，但是，有少部分正常/反應性的漿細胞出現CD56不同強度的表達[44]。CD28、CD45、CD81、CD27和CD200等異常標記也表達在一些正常漿細胞。但是，到目前為止，CD117還未發現表達于正常漿細胞。因此，不能僅憑一個或者兩個細胞標記判斷漿細胞的正常與否，對懷疑的小亞群漿細胞加做更多的抗原標記，如cKAPPA或cLAMBDA，提高檢測的敏感度[45-46]。

8 質譜流式細胞術[47]

目前的流式細胞檢測系統采用熒光基團標記抗體，熒光基團的發射光譜一般比較寬，會發生重疊，這一方面限制了檢測通道的數量，很多通道的信號需要復雜的補償計算；而質譜流式細胞儀采用金屬同位素標記，可以同時檢測大量的分子標記，實驗數據表明，相鄰通道間的干擾很少，無需計算補償；金屬元素在細胞中的含量極低，且金屬同位素與細胞組分的非特異性結合能力極低，所以信號背景也極低。采用飛行質譜流式細胞技術，可以同時檢測大量的分子標記，其不僅能檢測出極低量的骨髓瘤細胞，還可以分析其微環境，有助于評估新的治療方法和對耐藥的理解。質譜流式細胞術是利用質譜原理對單細胞進行多參數檢測的流式技術。它繼承了傳統流式細胞儀的高速分析的特點，又具有質譜檢測的高分辨能力。針對細胞表面抗原的靶向治療的出現，相應的就需要采用更多的抗體標記來檢測殘留的異常細胞，質譜流式細胞術通道間的低補償，可以同時檢測大量的分子標記，這是未來MRD檢測的一個新的技術。

9 小結

靶向治療以及免疫治療等新的治療方法的出現大大提高了治療的有效性和緩解率。傳統的骨髓細胞形態學和免疫化學檢測方法并不能充分評估患者的生存率和無進展生存期。MRD陰性的患者逐年增加，研究也證實了MRD陰性的患者具有更長的PFS和OS。影像學檢查有助于全面評估患者的緩解狀態，流式細胞術和分子檢測有具有較高的分析敏感性，但是每一種方法都有它自己的缺點。這也顯示出了平行分析各種檢測結果的重要性，尤其是在不同方法的檢測結果不一致的時候。隨著檢測技術的發展，識別罕見異常漿細胞的靈敏度可以達到10-6，分子檢測(AS0-PCR和NGS)、細胞檢測(MFC)都能有效的監測多發性骨髓瘤的MRD，這些監測方法也有助于臨床調整治療方案，而質譜流式細胞術將更有助于檢測出微量殘存的異常漿細胞。