二代測序技術在實體腫瘤診療中的應用進展

翚 纓 曾 灝

廣西壯族自治區貴港市人民醫院檢驗科，廣西貴港 537100

在臨床上，惡性腫瘤具有細胞分化、轉移、增殖等功能，發病機制十分復雜，可以劃分為致癌、促癌和癌細胞演進這三個不同的環節[1]。近年來，隨著醫療技術水平的不斷進步，二代測序技術作為一種大規模的平行測序技術，逐漸應用于臨床實體腫瘤的診療中，可以更好地分析腫瘤的發病機制、分子分型以及預后等各方面的信息，為臨床腫瘤的診療工作帶來了進一步的突破[2]。二代測序技術在腫瘤診療的過程中，可以通過信號通路和突變基因的技術應用，來識別實體腫瘤中的特異突變現象。目前，二代測序技術在實體腫瘤診療中的應用，明顯促進了分子生物學的發展歷程，并且也可以讓臨床醫學者在研究基因組的測序問題中，以低成本獲得高效率，在我國實體腫瘤的臨床實踐工作中，具有積極的促進作用。本研究將結合一些典型研究對二代測序技術在實體腫瘤診療中的應用進行如下綜述。

1 二代測序技術簡介

近年來，在人類基因研究的課題中，我們對于遺傳信息的掌握越來越清晰；與此同時，隨著科學技術的不斷發展，基因檢測技術的水平也得到提升，逐漸呈現出了規模化、工業化、專業化的特點。在第一代測序技術中，即Sanger 測序，雖其是基因檢測的金標準，讀長較長、精準，但由于其成本較高、通量低，限制了其在各個領域中的應用都存在部分缺陷[3]。而后經過技術人員的深入研發，在第一代測序技術中衍生了二代測序技術，與上一代測序技術相比，二代測序技術的范圍重點在于基因組重測序、目標區域測序以及全外顯子組測序，同時具有成本逐漸降低、通量高的優點，可以以高通量的輸入來篩選多種基因，改變篩選基因的靈敏度。此外，二代技術還可以對大量的平行基因進行測序，在臨床應用過程中，可以更好地探究實體腫瘤的變異性，為腫瘤的診療工作提供數據信息的支持。總的來說，二代測序技術對實體腫瘤的檢測結果與一代相比差異并不明顯，但是卻具有檢驗通量、時間和篩選方面的優勢，并且可以避免機體侵入性檢查，能達到早期診斷、及時治療的目的，同時在耐藥性和療效方面還具有明顯的監測效果。

2 二代測序技術在實體腫瘤中的應用

近年來，二代測序技術在各個領域中的應用都十分廣泛，特別是在腫瘤基因組學的研究中發揮了巨大的作用，用于突變基因、信號通路的探索以及識別特異性突變[3]。同時，二代測序技術還可以研究腫瘤質變的發展機制，有利于臨床診療的實施，進一步推進了我國醫學水平的進步。特別是在實體腫瘤的樣品檢測中，二代測序技術能夠了解機體病變組織的基因改變機制，并為臨床診療提供參考方向，有利于隨時調整用藥和靶向治療方案，達到理想的治療效果。在此，下文重點論述二代測序技術在實體腫瘤中的應用，并簡單分析二代測序技術在臨床應用的優點。

2.1 遺傳性乳腺癌（HBC）

乳腺癌的發病率位居我國女性惡性腫瘤的首位，尤其是以浸潤性導管癌為主。浸潤性導管癌是一種具有高度特異性質的疾病，在基因譜、生物特性以及診療方向中都存在一定的研究難度，因此在臨床上需要加強對此類患者腫瘤分期、病情診治方面的研究力度，更好地用于診斷治療以及預后評估中。在二代測序技術的應用中，基因表達譜不僅可以清楚了解患者的腫瘤分期情況和基因表達特性，同時還可以加深臨床對病理組織細胞調節情況的認識，進一步強調腫瘤組織中的生物學特性。有研究表明[4]，乳腺癌的發病因素與體細胞突變有關，這為臨床乳腺癌的診治工作提出了重要方向。在此條件下，可以通過對腫瘤細胞突變譜展開研究，明確乳腺癌的發展機制以及細胞分子的變化情況。Bennett 等[5]分別對三陰性乳腺癌患者予以RNA 測序和DNA 測序；Ellis 等[6]對所選的乳腺癌患者進行DNA 測序，均研究NGS 應用于體細胞突變譜的檢測效果。其中部分患者行全基因組測序，其余患者行外顯子組測序，兩組結果均提示，二代測序技術可以綜合基因組的發展情況，分析乳腺癌細胞分化、突變和轉移方面的特征，促進了臨床乳腺癌基因研究的進展。

HBC 在臨床上大多是由BRCA1 和BRCA2 突變引起的，兩者的基因編碼腫瘤可以抑制機體的蛋白生長、分化，造成DNA 修復功能受損，同時還對細胞周期的變異、基因轉歸、基因穩定方面起到關鍵作用。細胞組織突變會增加HBC 的發病風險，針對此類現象，臨床應加強對家族史患者的篩查和測試。傳統的DNA 測序具有檢測時間長、費用較高等缺點，而采取二代測序技術則可以達到低成本、高效率的效果，改善了傳統測序檢測方法的局限性，也能夠合理應用于臨床的常規診斷中。

2.2 胃癌（SC）

SC 是消化系統中常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活方式的轉變，SC 在臨床上的發病率逐漸上升。而近年來，有研究表明[7]，SC 的發病機制與基因因素的改變存在密切關系，其中包括基因突變、基因表達異常以及基因遺傳變異等。在二代測序技術中，可以通過對SC 組織的腫瘤分子標志物進行檢測，提取RNA 或者DNA 以獲得機體的基因信息，從而了解SC 患者發病進程、用藥等方面的問題；同時可以通過基因表達鑒別不同個體中的表達特點，更有利于預后，實現SC 轉歸向好，篩選出與基因表達異常的靶基因，剖析臨床診療方案的調控機制。Lim SM 等[8]對早期SC 患者的癌旁組織進行二代測序，研究機體基因表達水平的差異以及結構變化，結果顯示，在早期SC 患者的病理標本組織中，存在1602 個基因上調以及695 個基因下調；30% ～40% 的SC 患者還存在融合基因LRP5-LITAF，這提示早期SC 患者的基因表達異常多與腫瘤期數、侵入和擴散程度有關。其次，有學者[9]指出miRNAs 在實體腫瘤的病程演變中，也起到了至關重要的提示作用，在臨床診療方面也具有較大的潛力，同時還參與了SC 形成的多樣通路信號。Lin PH 等[10]在FFPE 標本中應用二代測序技術，分析其生物學信息，研究組織標本的RNA 降解、片段化程度。結果顯示，在新鮮冰凍的標本中提取RNA 具有完整保存的效果，而從石蠟中提取RNA，則會出現程度不同的降解現象，同時28S 和18S 的波峰相對來說表達并不明顯；miRNAs 的表達譜在新鮮冰凍標本中，相關系數為0.91，而在FFPE 標本中則為0.85，均提示FFPE 標本中的miRNAs 保存度更為完整，且可以通過二代測序技術進行SC病理組織的檢測。二代測序技術規模性和專業性較強，在SC 組織中的檢測可以準確描述細胞轉錄組的相關情況，并提示基因表達和結構變化的特征，揭示了腫瘤分子的分型。

2.3 肝癌（HCC）

HCC 是外科中常見的惡性腫瘤之一，目前臨床上對于肝臟惡性腫瘤的發病機制仍在研究中，大多數學者普遍認為其病因是多因素、多復雜的演變過程，但主要是受到飲食因素和環境因素的影響所致。目前，臨床上用于HCC 診斷的種類較多，傳統的檢測方法包括CT、核磁共振、超聲等，同時仍需要采取腫瘤標態物檢測，在檢測過程中對于腫瘤的體積有一定的要求，因而存在漏檢率較高的不足之處。而二代測序技術在肝癌的早期篩查中早已有著廣泛的應用，研究表明[11]，許多癌基因的分化發展與肝癌的易感性存在密切的關聯性。Stephens等[12] 在HCC 多個基因突變和發病機制研究中，發現許多癌基因與HCC 易感性關聯密切，進一步提出HCC 并不是單基因突變的惡性腫瘤這一概念，并且將腫瘤組織的基因作為篩查重點，對早期HCC患者進行血液檢測，提取其DNA 文庫，通過二次測序技術檢測患者血液中是否存在肝癌相關的基因樣本，即CtDNA。這提示二次測序可以用于HCC的早期診斷中，篩查率較高，確診率不斷向100%的方向靠近，同時還能依據檢測出現的靶點予以治療方案的指導，在研究靶點藥敏性中也具有明顯優勢和成效。

2.4 肺癌（LC）

在臨床上，LC 是發病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤。在2019 年，英國有關研究人員提出了一種新的檢測技術，即將血液檢測和計算機斷層掃描成像相結合，以便于早期LC 的識別和干預[13]。但是對于LC 伴隨EGFR 基因突變的患者來說，這種檢測方法效果較差，并且難以對臨床治療提供判斷方向。有研究表明[14]，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑在治療晚期非小細胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）中具有明顯優勢。而在二代測序技術的應用中，研究機體EGFR 基因突變的進程，可發現基因變化產生的區域均存在于酪氨酸激酶中。Barras 等[15]在表皮生長因子受體絡氨酸激酶抑制劑的研究中發現，NSCLC 伴EGFR 基因突變患者的治療效果，并提出EGFR 突變類型包括外顯子點突變、缺失突變、插入突變，主要發生于18 ～20號的外顯子。相關文獻報道表明[16]，EGFR 基因突變的不同程度均對臨床療效產生不同的指示性特征。然而，在實際的檢測工作中，由于LC 病理組織的活檢標本難以重復獲得，并且受到檢測時間的影響，待結果呈現之時癌細胞早已轉移或擴散，增加了手術治療的難度。約有54% 的組織基因突變患者，通過二代測序技術對EGFR 進行鑒定突變的測試，可以給予此類患者更多可選擇的治療機會[17]。針對此類情況，有學者[18]指出這是由于腫瘤細胞含量較低所致，因此在二代測序技術的應用中，還應同時加入更為靈敏的檢測方法，例如液體活檢。在液體活檢中，可以評析機體血液樣品標本中的CfDNA 水平，以確定靶向治療的患者，并對患者予以分子動態變化的檢測。

2.5 結直腸癌（CRC）

CRC 的發病率居于全球惡性腫瘤發病率的第三位，好發于老年男性群體，嚴重威脅著老年患者的生命安全，而在近年來，由于人們飲食結構的轉變，CRC 的發病趨勢呈現出了低齡化的特點。在腫瘤細胞的發展進程中，EGFR 全程參與其中，具有調節腫瘤細胞的作用，對其生長功能、修復功能以及侵襲、轉移方面都存在一定程度的影響，而在臨床治療中多以藥物的相互組合作為靶點治療的方法。但是，有學者指出[19]，EGFR 的單克隆抗體治療，即西妥昔單抗或者帕尼單抗，都難以普遍應用到臨床CRC 患者的治療中，因此需要非癌細胞轉移患者應用二代測序技術檢測用藥治療的反應，減少患者在治療過程中的不必要醫療支出，同時能夠更好地監測不良反應的發生情況。RAS 蛋白作為一種下游效應子，旨在將基因功能的變化情況從EGFR 傳輸至細胞內，成為信號傳輸的重要標志；而KRAS 用于預測生物標志物的有效性，對于具有KRAS 突變的患者來說，可以起到抑制劑的抵抗作用[20]。大約45% 的KRAS 外顯子2 的患者，難以從靶向藥物的提示中獲得理想的診療方向，而CRC 中的基因突變或者下游突變，受到遺傳基因異常改變因素的影響，導致抗EGFR 的耐藥性逐漸升高，臨床療效并不明顯，因此CRC 病理組織的異常特性是預測CRC 治療的關鍵。

2.6 其他腫瘤

除了上述五個比較常見的實體腫瘤外，二代測序技術在其他實體腫瘤的診斷、治療以及預后中的應用也是比較廣泛的。如食管癌、黑色素瘤、甲狀腺癌瘤等。喬云等[21]研究指出，在食管癌患者中應用二代測序技術探索敏感基因，可以提高放射治療的敏感性，這提示二代測序技術在食管癌患者的個體化治療中能夠予以特殊的干預和指導。Mari 等[22]通過NGS 來研究散發性甲狀腺髓樣癌的診斷分層，發現二代測序技術可以對甲狀腺癌的診治提供診療方向，更好地區分甲狀腺結節的分類變化，降低并發癥的發生率，改善診斷性穿測的發生情況。Adan 等[23]用二代測序技術、免疫組織學這兩種方法檢測黑色素瘤，包括檢測靈敏度、時間、成本等，結果顯示，二代測序技術對于黑色素瘤的檢測效果更為顯著，并且也闡述了分子診斷的多種優勢，倡導臨床不斷推進二代測序技術的應用。此外，Illumina 公司的TruSight Tumor 主要用于查看實體瘤中的體細胞變異情況，包括肺癌、結腸癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌，可以準確提示腫瘤患者基因突變的概率，并分析機體變異的具體情況[24-26]。而在實體腫瘤的預后方面，二代測序技術的應用可以為腫瘤篩查、診斷和治療提供新的方向，在臨床使用中具有巨大的發展潛能。

3 小結與展望

隨著現代醫學技術的蓬勃發展，臨床上逐漸將信息數據的模式應用于診療工作中，在實體腫瘤的診療過程中更是做到了個體化治療的精準結合，有效提高了診斷率和治療效果。而在現代醫學技術的應用中，二次測序技術作為一種新的檢測手段，旨在通過DNA 片段的深度探查，來獲得機體或疾病的基因組信息，明確腫瘤在病情發展階段的細胞變化情況。此外，二代測序技術具有靈敏度高、檢測時間段廣泛、通量高、信息量大等優點，在實體腫瘤的診療中起到了十分重要的作用。

綜上所述，二代測序技術的應用為實體腫瘤的診療工作帶來了更深層次的變革，特別適用于基因遺傳、變異等相對復雜的疾病種類研究中。在未來幾年，隨著二代測序技術的深入研究和應用，有望將其引進血液癌癥的診療中，不斷完善基因組譜的評估情況和臨床實踐，提高測序技術的實用性。與此同時，還應加強對第三代測序技術的研發，彌補原有測序技術的局限和不足，為臨床診治補充更為豐富的技術要點。在基因組學不斷變化發展的當下，測序技術也應適應新模式的轉變，有望將二代測序技術與三代測序技術相互聯合，應用于臨床實體腫瘤的診療工作中。