動物源腸球菌耐藥性研究進展

周芷錦 穆琳 王彬

（浙江省動物疫病預防控制中心 310020）

腸球菌是一類廣泛分布于環境、人和動物消化道內的革蘭氏陽性球菌，在分類學上屬于腸球菌屬，菌體為圓形或橢圓形，呈單個或成對或短鏈狀狀排列，無芽孢，無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌[1]。腸球菌是一類人畜共患的條件致病菌，可以引起人體尿路感染、皮膚軟組織感染，腹腔感染、敗血癥、心內膜炎和腦膜炎等。同樣有不少報道指出，腸球菌可感染雞、鴨、豬、牛、羊等主要食品動物，導致疾病發生[2-5]。既往，腸球菌作為腸道的正常菌群不被認為是重要的致病菌，但隨著人源腸球菌感染的發生率和死亡率明顯升高，美國醫院感染監測系統（NISS）已把腸球菌列為醫院感染的第二大病原菌[6]。據我國2010 年全國細菌耐藥性監測報告，腸球菌是除葡萄球菌外，臨床分離率第二的革蘭氏陽性菌[7]，與美國報告一致。潘航[8]等根據美國腸道細菌耐抗生素監測系統（NARMS）數據統計分析指出，在畜禽肉樣品中腸球菌檢出率最高（42%）。隨著抗生素的發明使用，特別是養殖環節抗生素的大量使用，腸球菌的耐藥性不斷增強，抗生素選擇范圍逐漸收窄，有研究指出，腸球菌可以在人與動物之間水平傳播[9]，這使得腸球菌的耐藥性研究不僅僅在單一領域，而是覆蓋公共衛生和農業畜牧養殖所要共同應對的問題。

1 腸球菌的檢測方法的研究

1.1 傳統細菌分離鑒定方法研究

綜合目前現行有效的標準，腸球菌的選擇性培養基包括KF 鏈球菌瓊脂培養基、腸球菌瓊脂培養基和MRS 瓊脂：腸球菌屬細菌在KF 瓊脂上形成暗紅至粉紅色菌落，在腸球菌培養基上形成帶棕色環的棕黑色菌落，在MRS 培養基上形成白色或乳白色菌落，菌落較小，表面光滑，邊緣整齊[10,11]。在現行有效的標準中選擇性培養基僅僅是一種初篩方法，需結合顯微鏡下的菌體形態和生化反應鑒定結果進行綜合判定。除了傳統的培養基外，隨著科技的進一步發展和實際應用，出現更加直觀的選擇培養基，即顯色培養基。張銀旺等[12]采用血平板加傳統生化鑒定和VTECK 全自動細菌鑒定系統與CPS4 顯色培養基進行比較，顯色培養基符合率在97%以上，且顯色培養基直接鑒定率在85.3%，相比傳統方法更簡便、快速、高效。隨著耐萬古霉素腸球菌的出現，對耐萬古霉素腸球菌的特異性檢測需求日益增加，耐萬古霉素腸球菌顯色培養基隨著出現，谷存國[13]等對血平板和耐萬古霉素顯色培養基（VRE ID）篩選腸球菌進行比較，兩者結果基本一致，顯色培養基更簡便。

1.2 分子生物學方法研究

分子生物學方法主要包括聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction,PCR）、多位點基因測序分析（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）Southern 雜交技術、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）等[14]。

1.2.1 聚合酶鏈式反應及其衍生方法

1985 年美國MILLER 等發明了聚合酶鏈式反應，是一種在體外模擬自然DNA 復制的核算擴增技術。該方法可以檢測特異性基因片段，花費的時間少，簡便高效，自20 世紀80 年代出現以來已被廣泛用于檢測，目前已成為腸球菌鑒定中常規的檢測方法。在普通PCR 方法上又衍生出熒光定量PCR 方法（Real-time Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR）和多重PCR 診斷方法。

1996 年美國Applied Biosystems 公司推出在普通PCR 技術上通過添加熒光染料或熒光標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產物，實現實時定量功能。吳程璐[15]等建立了以引物EF1902為基礎的熒光定量體系，并對腸球菌人工污染的牛奶進行檢測，當初始接菌量在2.63cfu/ml 時，只需增菌6h 即可用該方法檢測出腸球菌，52 份樣品中檢測準確率為94.23%。金東[16]等根據屎腸球菌的保守基因—d-丙氨酸聚連接酶基因（ddl 基因）設計引物和探針，建立了屎腸球菌的TaqMan 熒光定量PCR 方法。應用該方法檢測菌濃度在1.6×100～1.6×108cfu/ml 梯度間的屎腸球菌模擬樣本，其檢測靈敏度在1.6×102cfu/ml，檢測靈敏度更高。

多重PCR 技術可以使用兩對或多對不同的引物對同一DNA 模板進行擴增，以達到同時檢測的目的，其敏感性和特異性可達到95.5%和98.1%[17,18]。王亞賓[19]等以腸球菌的16S rRNA 基因和SodA 基因分別設計屬和種的特異性引物建立多重PCR 方法，同時檢測屎腸球菌和糞腸球菌兩種菌株，經過與16S rRNA 測序方法比較，對豬的臨床菌株、糞便菌株和鮮豬肉菌株的鑒定符合率為100%。林東昉[20]等建立了基于多重PCR技術的腸球菌萬古霉素高水平耐藥基因vanA、vanB、vanD 和vanM 快速檢測分型方法。檢測臨床分離的50 株VRE，與常規PCR 比較，敏感度和特異性度均為100.0%。

1.2.2 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）由日本科學家Notomi[21]等在2000 年發表于Nucleic Acids Research 雜志上。該技術一經面世便因其對設備要求低、反應迅速、靈敏度高等優點，得到世衛組織WHO 和各國學者的關注，并在此基礎上不斷研究優化應用于生物學、醫學和農學等各個領域。姜侃[22]等針對腸球菌16S rRNA 中高度保守的序列分析設計特異性引物建立乳品中腸球菌的LAMP 快遞檢測方法。結果表明，該方法可在14h 內完成檢測，靈敏度達到10fg/μL，比常規PCR 高3 個數量級。對164 批次嬰幼兒奶粉進行檢測，檢出率為22.6%，與行業標準檢測方法結果一致。

1.2.3 多位點基因序列分析（MLST）

多位點序列分析（Multilocus Sequence Typing,MLST）是采用多個保守基因位點對菌種進行鑒定分型的方法。通過公共數據庫（www.mlst.net）對全球范圍內的數據進行比較分析。應用于腸球菌研究的MSLT 主要集中在屎腸球菌和糞腸球菌[14]。該方法各針對兩種菌的7 個管家基因設計引物，對其進行PCR 擴增和測序，得出各個基因位點的等位基因數值，分析序列和等位基因圖譜，在此基礎進行系統聚類分析。楊晶[23]等對四川省自貢市肉及其制品中糞腸球菌進行耐藥性毒力基因和多位點序列分型分析，結果指出，相同的ST 型別的糞腸球菌有相似的耐藥譜圖和毒力基因攜帶情況。

2 腸球菌藥物敏感性實驗方法比較研究

腸球菌藥敏試驗方法在實際操作中按結果主要分為測量藥物紙片抑菌圈直徑大小的K-B 紙片瓊脂擴散法；檢測最小抑菌濃度（MIC）的微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及自動化藥敏檢測法；以及擴散法和稀釋法相結合的E-test 實驗。

2.1 K-B 紙片瓊脂擴散法

K-B 紙片瓊脂擴散法是目前應用較廣的一種藥敏實驗方法。該方法通過將浸有各類藥物的紙片貼在均勻涂布0.5 麥氏濃度菌液的M-H 瓊脂平板上，經過24h 培養后，測量抑菌圈的大小，對照判定標準快速判讀結果。抑菌圈的直徑與MIC 值呈負相關。目前實際操作中，K-B 法采用的是美國臨床和實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的標準。楊龍斌[24]等對江淮地區40 株豬源腸球菌進行K-B 法藥敏測試發現，40 株腸球菌均耐以上6 種藥物，耐以上8 種藥物的占95%，提示江淮地區豬源腸球菌多重耐藥現象很嚴重。K-B 法所要求的試驗條件相對較低，可廣泛應用于實際，但近期有報道[25]指出，在腸球菌檢測萬古霉素時，K-B 法測定結果與稀釋法和儀器法存在顯著差異，結果證明，在萬古霉素藥敏測定中K-B 法并不可靠。另外K-B 法的結果受限于培養時間、接種菌量、藥敏紙片的質量、瓊脂厚度等因素，并不適合作為藥敏判定結果的最終指標，更適合未知耐藥菌株的初步篩查。

2.2 微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及自動化藥敏檢測方法

微量肉湯稀釋法能有效測定出菌株的最小抑菌濃度，操作步驟標準化，商品化的藥敏板也已經開始在實際檢測中應用，是農業農村部動物源耐藥性監測工作的指定方法。瓊脂稀釋法與微量肉湯稀釋法在實驗原理上均為測試菌株的最小抑菌濃度，不同在于瓊脂稀釋法介質為固體瓊脂平板。瓊脂稀釋法通過將菌液點種在含有不同濃度藥物的瓊脂平板上，經培養后觀察其生長情況，以細菌不能生長的藥物濃度為MIC 值。瓊脂稀釋法同樣能精確的測定MIC 值，重復性好，能同時測定大量菌株，還能觀察被測菌株是否染有雜菌[26]，但當樣品量小時，其操作過于繁瑣，耗時過長，實驗試劑浪費過多。除了上述兩種手工操作方法外，目前市面上自動化的藥敏檢測儀器包括VITEK、Micro Scan、ATB 等系統。李萌[25]等利用VITEK32 細菌自動分析儀GPS-TB 藥敏卡檢測腸球菌對萬古霉素MIC 時，與肉湯稀釋法相比較，實驗證明兩者沒有顯著差異，對萬古霉素的藥敏結果可靠。自動化藥敏系統的優點在于高效、準確、操作簡便，但缺點在于成本較高，藥物種類受限較多。

2.3 E-test 實驗

E-test 實驗是結合K-B 法和瓊脂稀釋法的一種新的藥敏測試方法。該方法操作同K-B 紙片擴散法，簡便易操作，又利用預制的含有一系列藥物濃度的E-test 條，得到該藥物的最低抑菌濃度（MIC）值，具備稀釋法同樣的效果，且可選擇藥物種類多，在近年實驗室應用中越來越普遍。在E-test 實驗中，所采用的E-test 試紙條是實驗結果準確度最關鍵的耗材。劉亞麗[27]等比較了5 種國產試紙條（青霉素、氯霉素、萬古霉素、兩性霉素B 和氟康唑）和法國梅里埃進口試紙條的藥敏判定結果，兩者一致性較好，均準確可靠，國產試紙條在降低檢測成本的同時，可以提供準確的結果。

3 腸球菌耐藥機制的研究

腸球菌對抗生素的耐藥性可以分為天然性耐藥和獲得性耐藥。腸球菌的天然耐藥性由染色體基因決定的。腸球菌的細胞壁堅厚，對很多現有的抗生素有天然的耐藥性，如頭孢類抗生素、氨基糖苷類抗生素、克林霉素等。腸球菌的獲得性耐藥是腸球菌通過質粒、轉座子、整合子-基因盒系統等方式從其他細菌得到耐藥基因，從而使腸球菌產生耐藥性，如高水平的β-內酰胺類、萬古霉素、四環素等。

3.1 β-內酰胺類耐藥

β-內酰胺類抗生素的作用機理是通過抑制青霉素結合蛋白，阻礙細胞壁的合成，從而殺死細菌。20 世紀80 年代早期發現了β-內酰胺類耐藥的腸球菌，研究其耐藥原因，主要是因為其能產生β-內酰胺酶。腸球菌的β-內酰胺酶由tem 基因編碼，其耐藥機制是低親和力的青霉素結合蛋白的過度產生及此蛋白對青霉素結合力的減弱[28]。王蒙蒙[29]等報道，我國新疆北疆地區的49 株豬源糞腸球菌中tem 基因的檢出率最高，為93.88%。顧欣[30]等報道，上海地區的133 株糞腸球菌中tem基因的檢出率為63.2%，在耐藥表型陽性的菌株中的tem 基因檢出率為85.7%，基因型陽性的菌株耐藥表型均為陽性，結果表明，攜帶tem 基因是導致糞腸球菌耐藥的主要原因。

3.2 大環內酯類耐藥

腸球菌對大環內酯類藥物的耐藥基因主要包括介導藥物靶位改變的紅霉素核糖體甲基化酶基因（Erm 基因）、介導抗生素主動排外的mefA 基因和msr 基因等。Erm 基因通過對細菌23sRNA 轉錄后的修飾作用，影響了23sRNA 與藥物結合的空間結構，從而減少藥物的結合，產生耐藥性[31]。已發現的erm基因有20 余種，腸球菌中的Erm 基因主要是ErmB。mefA 基因和以ATP 為動力的msr 基因都是抗生素主動排外基因。該類基因通過編碼轉運蛋白，將抗生素泵出菌體外，使細胞內的抗生素濃度降低，從而產生耐藥性。王偉軍[32]等對臨床分離的72 株糞腸球菌進行耐大環內酯類藥物耐藥基因 （ErmB、ErmTR、mefA 和mefE）檢測，發現57 株（79.1%）檢出ErmB基因，54 株耐紅霉素的菌株中ErmB 基因的攜帶率為96.4%，未檢出其他3 種耐藥基因。顧欣[30]等檢測上海地區的133 株糞腸球菌，其中132 株耐紅霉素，ErmB 的檢出率為95.5%，未檢出mefA 基因，在耐藥表型陽性的菌株中ErmB 基因檢出率為96.2%，基因型陽性的菌株耐藥表型均為陽性，結果表明，ErmB 基因是導致紅霉素耐藥的主要原因，mefA 基因的主動排外機制未發現。關于糞腸球菌耐藥的主動排外機制有待進一步研究。

3.3 四環素類耐藥

腸球菌獲得四環素耐藥除了極少出現的自身染色體突變導致的以外，主要是獲得外源耐藥基因導致。外源基因作用機制主要分為核糖體保護機制，如tetM 基因和抗生素主動外泵機制，如tetL 基因。已發現的四環素耐藥基因有近50 種，包括核糖體保護蛋白基因12 種、外排泵基因30 種等[33]。目前腸球菌耐藥基因研究文獻報道中最多的是核糖體保護蛋白基因tetM，其編碼的核糖體保護蛋白，使得腸球菌對四環素類藥物產生抗性。王蒙蒙[29]等報道，我國新疆北疆地區的49 株豬源糞腸球菌中tetM 基因檢出率僅次于tem 基因，達到85.71%。顧欣[30]等報道在上海地區分離的133 株糞腸球菌中耐紅霉素的為129 株，tetM 基因檢出率為91.0%，基因陽性與表型陽性符合率在93.8%。王鈴飛[34]等對14 株屎腸球菌進行四環素耐藥基因檢測，分別有13 株tetL 和9 株tetM，其中9 株同時攜帶tetM 和tetL，提示豬屎腸球菌的耐藥性主要與這兩種耐藥基因有關。

3.4 氨基糖苷類藥物

腸球菌對低濃度的氨基糖苷類藥物具有天然耐藥性。美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS) 建議將腸球菌在氨基糖苷類藥物上的耐藥程度分為中度耐藥和高度耐藥。目前已知的有高水平慶大霉素耐藥、高水平鏈霉素耐藥等[35]。腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥主要是其獲得編碼氨基糖苷類修飾酶的基因所導致的。氨基糖苷類修飾酶目前已知有30 多種，其中最常見的4 種包括由aac (6′)/aph (2") 基因編碼的能使青霉素或糖肽類藥物與氨基糖苷類藥物協同作用消失的6′位-乙酰轉移酶/2"位-磷酸轉移酶AAC (6′)/APH (2") 雙功能酶；由aph (3") -Ⅲ編碼的3′位-磷酸轉移酶APH (3′) -Ⅲ；有ant (6) -Ⅰ編碼的6 位-核苷轉移酶ANT (6) -Ⅰ；由ant (2") -Ⅰ編碼的2"位-核苷轉移酶ANT (2") -Ⅰ。賈偉[36]等研究表明，在高水平氨基糖苷類耐藥的糞腸和屎腸球菌中aac (6′)/aph (2") 的陽性率分別為88.5%和52.4%，檢出率占比最高。齊亞銀[37]等在動物源（牛、羊、豬、雞）糞腸球菌的耐藥基因檢測中發現，aac (6′)/aph (2") 檢出率達到55%，ant (6) -Ⅰ檢出率大道55%，aph (3") -Ⅲ檢出率達到25%，與耐慶大霉素表型60%的檢出率基本一致。

4 小結

自第一種抗生素發現以來，人類對抗生素的應用在不斷加大、加深，其應用范圍不只局限在治療人類疾病，更多地應用在養殖業上。除了用于治療食品動物的疾病外，更多的是添加到飼料中起到預防疾病和促生長作用。據報道，2010 年我國食品動物中抗生素的使用比例已到全球的23%，位列第一，遠超第二的美國[8]。在抗生素用量逐年增加，細菌耐藥性問題已成為不可避免的難題，特別是有研究表明，動物源的耐藥菌和耐藥基因可沿“養殖動物-環境-食品-人群” 鏈條傳播[38]，使得細菌耐藥性的研究不僅是醫學問題。腸球菌作為一種人畜共患的條件致病菌，由于其基因的可塑性強，成為耐藥基因的存儲庫，對其耐藥性發展的研究成為熱點。汪玲[39]等對人源和動物源性腸球菌ErmB 基因進行研究，試驗表明，ErmB 基因在體外條件下可在人源和動物源腸球菌之間傳遞。另外，人源和動物源腸球菌及不同種屬的腸球菌有相同的ErmB 等位基因，提示其耐藥基因在動物源和人源水平傳播存在可能性。

基于目前的研究成果反映的現狀，為了遏制動物源細菌耐藥性的進一步發展，我國農業農村部出臺了各項政策，包括《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016-2020 年）》《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017-2020 年）》等，采取了限制促生長類抗生素的使用，建立全國范圍動物源細菌耐藥監測體系等措施。未來隨著各種檢測技術，特別是分子生物學的發展，對動物源腸球菌耐藥性的研究，及其人畜之間傳播的可能性研究更為值得關注。