抗菌肽殺菌效果、機制研究方法進展

時志琪 連凱琪 林正丹 馬園園

（安陽工學院生物與食品工程學院/河南省動物疫病防控與營養免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室 455000）

抗菌肽是機體內抵御體外病原感染時生成的一類小分子物質，構成生物體內的天然保護屏障，可以通過直接殺傷病原微生物或通過調節體內免疫系統抵御入侵，對多種病原微生物具有抑制作用，如病毒、真菌、細菌、寄生蟲等，也能殺死變異的腫瘤細胞等[1]。抗菌肽的來源十分廣泛，包括昆蟲、哺乳動物、兩棲動物、魚類、軟體動物和甲殼類動物及植物等[2]。近些年，抗生素不科學地使用造成了很多嚴重的問題，尋找抗生素替代品迫在眉睫。因抗菌肽的抗菌譜廣、種類多、抗菌機理獨特、不容易產生耐藥性，通常被認為是很具應用前景的抗生素替代品[3]。本文基于前人的研究，對抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動力學曲線及殺菌機制的研究方法展開綜述，為以后抗菌肽的研究做鋪墊。

1 抗菌肽抑菌效果研究方法

1.1 濾紙片法

濾紙片法是做細菌藥敏試驗的常用方法，研究者借鑒該方法對抗菌肽的抑菌效果進行研究。潘曉倩等[4]用濾紙片法研究不同濃度抗菌肽Nisin 對3 種不同細菌的抑菌效果。濾紙片法操作簡單，結果直觀，但無法控制濾紙片對抗菌肽的吸附量（即無法做到對實驗的定量），重復性較差。

1.2 牛津杯法

牛津杯法是國內外測定抗菌肽效價的通用方法，但若是使用方法或者操作不當，容易出現抑菌圈不明顯甚至無抑菌圈等現象。潘曉倩等[4]利用牛津杯法對抗菌肽Nisin 對不同細菌的抑菌活力進行測定。此法可以做到對加入的抗菌肽定量，但需要的劑量較大，且操作較為復雜，在放置牛津杯時力度不易掌控，容易滑動甚至倒翻，需要操作者有嫻熟的操作技巧和經驗。

1.3 打孔法

殺菌效果的研究方法中打孔法較為常用。該法操作簡單，重復性好，且可以做到定量，對操作者的要求也相對較低，是殺菌效果研究方法中較為理想的一種，因此，在抗菌肽抑菌效果研究中經常被使用。王利鋒等[5]曾用打孔法研究大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對不同細菌的抑菌效果。

1.4 活菌計數法

活菌計數法是取一定量經抗菌肽處理后的菌液進行涂板，培養一定時間后記錄平板上的活菌數量。姜太玲等[6]用活菌計數法研究花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌效果。這一方法最大的不足之處就是工作量較大，每一個濃度的涂板至少要重復3 次。但其操作簡單，結果直觀準確，可以很好地判斷抗菌肽的殺菌效果。

2 抗菌肽最小抑菌濃度檢測方法

2.1 刃天青顯色法

利用刃天青具有氧化還原這一特性，對抗菌肽的最小抑菌濃度進行測定。即將刃天青加入無菌液體中呈原本的藍色，加入有菌的液體中會變色呈紅色。鐘亨任[7]利用刃天青顯色法鑒定了抗菌肽Brevinin-GR23 對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。利用該方法鑒定最小抑菌濃度時，可以在培養結束后先目測渾濁度，對其抑菌效果進行初步判斷，然后再加刃天青顯色，使結果更加準確可靠。但操作一定要十分嚴謹，做到完全定量，否則容易出現重復試驗結果不一致的問題。

2.2 測吸光度法

抗菌肽的最小抑菌濃度也可以通過測吸光度來判斷，鐘亨任[7]在做刃天青的同時也測了吸光值。其結果與刃天青顯色法結果一致。但影響吸光值的因素有很多，這些因素會造成結果不準確，因此，該方法判定最小抑菌濃度的可信度較低，僅可作為參考。

3 殺菌動力學曲線研究方法

3.1 測OD 值法

對抗菌肽殺菌動力學曲線的研究，趙雪芹[8]曾采用測OD值法，研究沙門氏菌經不同濃度抗菌肽處理后，在不同培養時間下的存活量，結果顯示，該抗菌肽對沙門氏菌有很好的殺菌效果，且呈劑量依賴性。該方法操作簡單，工作量小，耗時短，但影響OD 值的因素較多，得出的數據誤差較大，可靠性低。

3.2 平板計數法

張煒[9]等采用平板計數法研究抗菌肽對大腸桿菌的殺菌動力學曲線，結果表明該，抗菌肽對大腸桿菌有明顯的抑制作用，可以很好地殺死大腸桿菌，且呈時間依賴性。在利用平板計數法測定抗菌肽的殺菌動力學曲線時，每一個濃度涂板至少需要重復3 次，工作量大大增加。與測OD 值法相比，雖然平板計數的工作量較大，但其結果更直觀、更準確。

4 抗菌肽抑菌機制的研究方法

抗菌肽的抑菌機制有很多，可通過改變細胞膜的通透性，破壞細胞膜的完整性；與DNA 作用，影響蛋白質的合成等來達到抑菌作用。研究者通過熒光染色、電鏡觀察、凝膠阻滯電泳等方法對抗菌肽的抑菌機制進行研究。

4.1 熒光染色法

抗菌肽可以增加細胞膜的通透性，使細胞膜的完整性受損而達到殺菌作用。碘化丙啶（PI）作為一種熒光顯色劑，可以穿過破損的細胞膜對細菌染色。Qinghua Zhang 等[10]通過測定細菌對PI 的吸收來確定細菌膜通透性的改變。該方法比較直觀生動地反應細胞膜通透性的變化，在研究抗菌肽對細菌細胞膜的研究中經常被采用。

4.2 電鏡觀察法

用電子顯微鏡觀察經抗菌肽處理的細菌能直觀地看出抗菌肽對細菌形態結構的作用。謝海偉等[11]使用電鏡觀察合成抗菌肽對大腸桿菌F41 的作用，結果顯示，細菌細胞的形態產生了很明顯的變化；馮興軍等[12]通過透射電鏡觀察經鴨抗菌肽處理后的大腸桿菌的結構形態。該方法最直接顯示抗菌肽對細胞的殺傷效果，通常作為抗菌肽殺菌的重要數據，但需要較高的試驗儀器，透射電鏡和掃描電鏡。

4.3 凝膠阻滯電泳法

抗菌肽還可以通過與DNA 的作用來發揮其抑菌效果。裴志花[13]檢測家蠅抗菌肽MDAP-2 與DNA 的結合能力。吳希[14]研究表明，抗菌肽能與真菌的DNA 和RNA 結合。該方法也是研究抗菌肽抑制細菌的一種分子檢測方法，通常被作為實驗室檢測抗菌肽是否作用于細菌DNA 的檢測手段。

5 小結

隨著抗生素耐藥菌株的出現及對環境污染的日益嚴重，學者們越來越重視抗菌肽方面的研究。抗菌肽抑菌效果和抑菌機制的研究方法很多，筆者在抗菌肽現有研究方法的基礎上進行歸納總結，比較研究了抗菌肽抑菌作用更合適的方法。本文簡要概述抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動力學曲線及殺菌機制的研究方法，通過比較前人研究基礎推測，殺菌效果的研究方法中打孔法最優；MIC 測定最優方法為刃天青顯色法，而殺菌動力學曲線使用平板計數法最為準確；對于殺菌機制的研究，不同的殺菌機制需要不同的研究方法。當然，隨著不斷地探索和科學技術的進步，也許會有更好的研究方法可以更全面、深入地研究抗菌肽。