結核分枝桿菌細胞外RNA的研究現狀

李婷 范云帆 付英梅

細胞外RNA(extracellular RNA，exRNA)指存在細胞外的所有RNA，包括轉運RNA(transfer RNA，tRNA)、核糖體RNA(ribosome RNA，rRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)以及各類非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[1-2]。目前發現的exRNA主要位于胞外囊泡中，也有部分以核糖核蛋白和脂蛋白結合的形式存在。在真核生物與原核生物細胞中均能觀察到exRNA的包裝和釋放現象。人體中exRNA由多種細胞產生，在不同疾病中顯示出差異性表達，所以有作為生物標志物的潛力[3-4]。此外，借助胞外囊泡的靶向作用，exRNA在靶向治療的研究和應用上具有廣闊的前景[5-6]。

近幾年發現，結核分枝桿菌也能產生exRNA，這一過程與細菌分泌系統和宿主靶細胞外泌體密切相關。結核分枝桿菌的exRNA可影響宿主細胞免疫功能，從而對結核病的發生發展產生影響。并且，在感染結核分枝桿菌后，細菌exRNA可以被轉運到宿主外周血和體液中，所以在篩選微創或無創生物標志物方面蘊藏著巨大的潛能。

一、 結核分枝桿菌exRNA的發現

20世紀70年代，人們就已在人淋巴細胞的培養基中，發現細胞釋放的核蛋白復合物中存在RNA，并且認為這一過程是活細胞主動分泌而非細胞死亡裂解釋放的[7]。早期對exRNA研究主要關注人類外周血和其他體液中人體基因組來源的exRNA[8-9]。近幾年，研究人員開始探討人體內共生或寄生的其他生物的基因組來源的exRNA，包括寄生蟲、真菌、細菌產生的exRNA。

2012年，Obregón-Henao等[10]收集了結核分枝桿菌培養濾液，進一步用化學方法提取其中的RNA成分，并使用基因克隆技術和BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析確認了這些exRNA的長度和種類，這是研究者首次發現并證明了結核分枝桿菌exRNA的存在。作者發現這些exRNA在細菌培養的對數生長早期開始積累，長度在30～70堿基之間，以tRNA和rRNA為主。

隨著深度測序技術的廣泛應用，所發現的結核分枝桿菌exRNA的分子類型也不斷增多。2015年，Singh等[11]結合深度測序技術，在結核分枝桿菌感染的小鼠巨噬細胞RAW264.7的外泌體中，發現了14種結核分枝桿菌的mRNA，例如Rv3809c、 Rv3533和Rv0243等。隨后，其他研究者又陸續在人外周血中發現結核分枝桿菌的exRNA。2017年，Lv等[12]利用深度測序技術在人血清的外泌體中檢測到結核分枝桿菌的rRNA和mRNA。通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法也可在人血漿游離RNA中檢測到結核分枝桿菌小RNA(small RNA，sRNA)產物[13]。2019年，結核分枝桿菌來源的微小RNA(microRNA，miRNA)也在血清游離RNA中檢測到[14]。

目前，已發現的結核分枝桿菌exRNA包括tRNA、rRNA、mRNA、sRNA和miRNA，這些RNA常以片段形式存在，長度在20～300堿基不等[10-15]。這表明多種類型的結核分枝桿菌RNA片段均可釋放到細胞外。

二、 結核分枝桿菌exRNA的產生途徑及機制

目前已發現的結核分枝桿菌exRNA的產生途徑主要與胞外囊泡相關。細胞外囊泡是由細胞衍生的釋放到外環境中的多種膜性囊泡的統稱，在生物界中普遍存在。在原核生物中，革蘭陰性菌產生的胞外囊泡源自外膜，因此通常稱為外膜囊泡[16]。而革蘭陽性菌、真菌以及分枝桿菌因存在厚細胞壁，對囊泡的產生機制還不清楚，這類原核生物產生的膜性囊泡依舊統稱為胞外囊泡[17]。在真核生物中，依據產生的機制不同，胞外囊泡又可大致分為外泌體和微囊泡[18]。有關外泌體和微囊泡的生物學知識，van Niel等[18]已做出詳細的介紹，此處不再贅述。

細菌胞外囊泡在exRNA的包裝和分泌過程中起作用已在多種細菌中得到驗證[19-21]。Dauros等[22]也在恥垢分枝桿菌的胞外囊泡中鑒定了RNA的存在。結核分枝桿菌能產生富含脂類、糖類和蛋白質成分的胞外囊泡[23-24]，并且分泌至培養濾液中RNA的含量與濾液中的蛋白含量呈正相關[10]。所以，筆者推測，在結核分枝桿菌培養基濾液中所檢測到的exRNA很可能也是經細菌的胞外囊泡所包裝和分泌。但目前為止，對結核分枝桿菌胞外囊泡中exRNA的鑒定，還沒有明確的報道。

在感染宿主靶細胞后，作為兼性胞內寄生菌，結核分枝桿菌的exRNA主要通過宿主靶細胞的外泌體轉運至細胞外[11,25]。雖然目前對于這一過程中exRNA的包裝、細胞內轉運和釋放等機制還知之甚少，但最近有報道顯示，結核分枝桿菌分泌系統中的替代型分泌系統(accessory Sec system，SecA2)可能參與感染細胞內細菌exRNA的細胞內轉運過程。SecA2對結核分枝桿菌在巨噬細胞內的生長必不可少，它能通過影響v-ATPase來抑制吞噬體的酸化過程，阻止吞噬溶酶體的成熟[26]。2018年，Cheng和Schorey[15]發現SecA2介導H37Rv結核分枝桿菌RNA從菌體內釋放到外環境的過程。在培養結核分枝桿菌時， SecA2功能缺失導致細菌培養濾液中exRNA表達消失，而在SecA2功能補充菌株的培養濾液中，結核分枝桿菌的exRNA的表達量恢復至野生型H37Rv水平。并且，作者發現，細菌進入巨噬細胞后，SecA2對exRNA的釋放仍然起作用。結核分桿菌被巨噬細胞吞噬后，進入吞噬體，細菌在SecA2的介導下將細菌RNA釋放到吞噬體中，接著在結核分枝桿菌 ESAT-6分泌系統1(ESAT-6 secretion system-1，ESX-1)的參與下，將細菌exRNA從吞噬體內分泌至巨噬細胞胞質中。

分泌到細胞質的結核分枝桿菌exRNA如何包裝至外泌體的機制還不了解。不過，在SecA2缺失時，被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞的外泌體中細菌exRNA顯著下降[25]。這可能與巨噬細胞外泌體的生成有關。細胞內多囊泡體與質膜融合，將其腔內囊泡釋放到細胞外而形成外泌體[27]。在外泌體的形成過程中，細胞質中的一些成分被隔離在囊泡中，包括蛋白、脂質以及核酸類物質[28-30]。所以可推測，當SecA2缺失時，因結核分枝桿菌的RNA不能釋放到細菌細胞外，使巨噬細胞的胞質中結核分枝桿菌的exRNA表達降低，最終導致被包裝到巨噬細胞外泌體的細菌exRNA表達減少。

除了在體外感染實驗中驗證了感染細胞外泌體中含有結核分枝桿菌 exRNA，在對結核病患者血漿外泌體的深度測序研究中也發現了結核分枝桿菌來源的exRNA[12]，提示在感染后，結核分枝桿菌的RNA可能通過宿主細胞外泌體的途徑，被轉運到外周血中。

三、 結核分枝桿菌exRNA對宿主細胞的影響

在感染的靶細胞中，結核分枝桿菌可直接將其RNA分泌到宿主細胞的胞質中，也可通過被感染細胞的外泌體，將細菌exRNA轉運到臨近或遠離的未感染細胞中，從而發揮生物效應。這些病原體RNA可以作為“病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns， PAMP)”被宿主細胞中的胞質RNA傳感器識別，最終調節宿主的免疫反應[31-32]。

干擾素(IFN)-β是Ⅰ型干擾素中的一員，結核分枝桿菌誘導IFN-β是激活先天免疫的重要步驟。之前研究報道結核分枝桿菌的DNA觸發IFN-β的產生[33-34]。最近發現，結核分枝桿菌exRNA可以作為PAMP被胞質RNA傳感器視維甲酸誘導基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene I， RIG-I)識別，在RNA傳感通路線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein， MAVS)和TANK結合激酶1的作用下，使干擾素調節因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)磷酸化，被磷酸化的IRF7形成同二聚體進入細胞核中促進IFN-β mRNA表達，最終使巨噬細胞中IFN-β蛋白的表達增多，從而驅動宿主的免疫反應[15， 25]。另一方面，巨噬細胞外泌體中的結核分枝桿菌exRNA可以通過RIG-I/MAVS途徑促進骨髓來源巨噬細胞中吞噬體成熟，從而抑制結核分枝桿菌的生長[25]。這表明與靶細胞外泌體相關的結核分枝桿菌RNA有利于靶細胞的抗菌反應。

結核分枝桿菌exRNA也可以引起宿主細胞凋亡。研究者發現結核分枝桿菌培養濾液中的exRNA可以通過不依賴于TNF-α的caspase8信號機制損傷細胞膜，導致細胞凋亡[10]。結核分枝桿菌的外泌體exRNA轉染至幼稚巨噬細胞后，可使細胞內的磷脂酰絲氨酸水平升高[11]。磷脂酰絲氨酸暴露增加與細胞凋亡的早期事件有關，提示外泌體exRNA可以誘導受體細胞凋亡的可能性[11]。巨噬細胞的凋亡不利于結核分枝桿菌生長和繁殖環境的形成，可引起細菌的清除，從而發揮內在保護作用[35]。這可能為結核病的治療提供新的見解。

近期，Chakrabarty等[14]在人外周血中檢測到結核分枝桿菌exRNA，通過生物分析預測了這些exRNA的靶基因及其功能，發現這些exRNA與宿主細胞的周期、凋亡、轉錄調控、mRNA加工、脂質代謝、細胞間通訊有關。提示結核分枝桿菌exRNA可能在影響宿主細胞功能上發揮多種作用。但是，目前exRNA功能性的研究僅在體外培養實驗中得到驗證，對于存在于人體內exRNA的功能還有待考究。

四、 結核分枝桿菌exRNA在醫學中的應用

近幾年，外周血或其他體液中來源于細菌的exRNA能否作為感染性疾病的診斷標志物引起了研究者的極大興趣。2017年，Lv等[12]在對健康個體、潛伏性結核感染者和活動性結核病患者的血清外泌體測序中發現，在潛伏性結核感染者血清外泌體中檢測到種類遠超其余兩組的結核分枝桿菌RNA。證明在結核分枝桿菌不同感染狀態的人群中，血漿樣本中來源于病原體的exRNA具有明顯差異。對血清樣本直接提取總RNA并測序后也發現，在結核病患者血清中檢測到6個結核分枝桿菌來源的miRNA(MTBmiR1～6)，其中MTBmiR5在診斷肺結核患者時，敏感度為100.00%，特異度為90.91%[14]。另一項研究也發現，使用RT-PCR的方法檢測活動性結核患者和健康人血漿中的結核分枝桿菌特異性sRNA，發現結核分枝桿菌的sRNA ASdes在兩組間的檢出率分別為55.56%和25.00%[13]。這證明了外周血中來源于病原體的exRNA在診斷感染性疾病中的巨大潛力，對利用這些差異表達的結核分枝桿菌RNA診斷結核病患者提供了理論依據。

mRNA作為疫苗，不僅肌內注射后可在局部肌細胞內翻譯相應的蛋白質[36]，也可皮內注射后，在接種部位刺激產生趨化因子和細胞因子，從而促進機體免疫系統的激活[37]。細菌來源的mRNA也可作為疫苗，誘導宿主對細菌的免疫應答，為小鼠提供部分保護作用[38]。攜帶有結核分枝桿菌exRNA的巨噬細胞外泌體可以限制結核分枝桿菌在宿主細胞中的復制，與莫西沙星合用后，可協同降低巨噬細胞內和小鼠體內結核分枝桿菌的存活率[25]。這為結核分枝桿菌exRNA的疫苗研發及在治療方面的應用提供了理論基礎，并等待進一步的發掘。

五、 展望

近幾年，exRNA的生成機制、生物學功能及作為疾病生物標志物的研究日益得到人們的關注，并取得一定的進展。美國國立衛生研究院也發起了細胞外RNA通訊聯盟(Extracellular RNA Communication Consortium，ERCC)，致力于了解exRNA生物學功能及特性，并加快發展exRNA的研究和應用，將其作為潛在的治療方法和診斷方法。目前結核分枝桿菌的exRNA研究尚處于起步階段，關于其產生機制、生物學功能及其在臨床醫學上的應用還需做進一步探索。隨著對結核分枝桿exRNA的研究進一步加深，或許可以為結核分枝桿菌感染的診斷、治療及預后評價提供新的思路。