神經生長因子在慢性阻塞性肺疾病大鼠血、肺組織、支氣管灌洗液中的表達

李渺苗 邵宏濤 李寧 孔鋮英 孫麗 蔣濤

(1浙江大學醫(yī)學院附屬第四醫(yī)院呼吸與危重癥學科，浙江 義烏 322000；2南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院；3江蘇省中醫(yī)藥研究院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、并呈進行性發(fā)展〔1〕。吸煙是COPD的主要危險因素，慢性炎癥是COPD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，但令人費解的是，即使戒煙后肺部的炎癥仍然存在，所以炎癥一旦啟動，就會一直持續(xù)存在，并進行性加重，形成惡性循環(huán)〔2〕。目前缺乏統(tǒng)一標準的COPD動物模型構建方法，尤其是在停止造模干預后仍顯示出COPD的特征性變化的造模方法。神經生長因子(NGF)在肺組織中廣泛表達，在不同微環(huán)境下，NGF通過表達變化及介導細胞功能的發(fā)揮參與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展，如支氣管哮喘、肺結節(jié)病、肺癌、肺纖維化等〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)香煙刺激COPD大鼠肺巨噬細胞高表達NGF〔4〕。因此觀察NGF在COPD、戒煙COPD中的表達變化有助于進一步闡述COPD炎性持續(xù)存在的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠24只，平均體重(145±15)g，清潔級，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。實驗動物合格證號：SCXK(軍)2012-0014。

1.2試劑與儀器 大豐收牌香煙由中國煙草總公司監(jiān)制(含焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)；NGF上下游引物由南京金斯瑞公司合成；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara大連寶生物有限公司；實時熒光定量PCR儀為美國ABI StepOne定量PCR儀；大鼠NGF ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3動物模型的建立 將24只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、COPD組，戒煙1個月COPD組，每組8只。采用單純煙熏法建立COPD大鼠模型：將大鼠置于自制的熏箱(70 cm×50 cm×30 cm)內，每次點燃5只香煙，2次/d，共暴露2 h/d，每周5 d，連續(xù)6個月。戒煙1個月COPD組：按COPD大鼠模型進行香煙刺激6個月后，停止香煙刺激1個月。正常對照組亦同時放入另一相同自制熏箱做偽暴露，余飼養(yǎng)條件相同。

1.4肺組織病理HE染色 2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(30 mg/kg)，心臟抽血處死，將右上肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，脫蠟，HE染色，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5支氣管肺泡灌洗進行細胞分類計數(shù) 麻醉大鼠后，75%酒精浸泡消毒2～3 min，移至超凈工作臺，固定四肢，逐步暴露氣管后，絲線結扎上端氣管防止灌洗液倒流，靜脈留置針行氣管穿刺，成功后退金屬內芯并將塑料套管緩慢送入氣管約1 cm，經套管注入PBS行支氣管肺泡灌洗，每次5 ml，共6次，灌洗時輕柔按摩雙肺1 min后回吸。收集灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，DMEM重懸細胞，在光鏡下行有核細胞計數(shù)。吸取100 μl細胞懸液行細胞涂片，經瑞士吉姆薩染色。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定3組大鼠血、肺組織、支氣管肺泡灌洗中NGF蛋白表達 取3組大鼠右下肺0.5 mg左右，充分剪碎，研磨，加入約 500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清。取3組大鼠血液2 ml，1 000 r/min離心5 min，取上清。收集支氣管灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，取上清。配制1 000.0 pg/ml，500.0 pg/ml，250.0 pg/ml，62.5 pg/ml，31.3 pg/ml，15.6 pg/ml的標準品，并依次加入一排7個孔中，1孔只加樣品稀釋液做為零孔。其余孔加入樣品稀釋液稀釋的上清液100 μl，酶標板加上蓋，37℃反應90 min，甩去酶標板的液體，對著吸水紙拍4次，不洗，加入NGF抗體工作液100 μl，37℃反應60 min，甩去液體，PBS洗3次，每次1 min，加入100 μl ABC工作液，37℃反應30 min，甩去液體，PBS洗5次，每次1 min，加入90 μl TMB顯色液，37℃避光反應25 min，加入100 μl TMB終止液，用酶標儀在460 nm測定OD值。

1.7實時熒光定量PCR檢測3組大鼠肺組織、支氣管灌洗液NGF mRNA表達 按照總RNA提取試劑盒提取的總RNA，并測量RNA的濃度，根據逆轉錄試劑盒操作合成cDNA，反應條件(30 μl反應體系)為：37℃ 30 min，85℃ 5 s。NGF上游序列為5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′，下游序列為5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′，內參照GAPDH上游序列為5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游序列為5′-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3′。實時熒光定量PCR反應體系采用SYBR GreenⅠ，其最終反應體系為20 μl，采用兩步法擴增，最后得到熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)。NGF mRNA相對表達量用2-ΔΔCt進行比較。ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCtCOPD組-ΔCt正常對照組。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

2.1大鼠肺組織HE染色 COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織HE染色均可見肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂、肺泡腔不規(guī)則擴大，部分融合形成肺大皰，肺氣腫形成明顯，見圖1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE，×100)

2.2大鼠肺功能檢測結果 相比正常對照組，COPD組、戒煙1個月COPD組肺順應性和每分鐘通氣量均明顯下降，氣道阻力明顯升高(均P<0.05)。見表1。COPD組戒煙1個月COPD組均出現(xiàn)氣流受限，肺通氣功能障礙，即使戒煙，COPD大鼠仍存在肺通氣功能障礙。

2.3支氣管肺泡灌洗液細胞分類 正常對照組支氣管灌洗夜中白細胞總數(shù)及肺泡巨噬細胞，明顯少于COPD組、戒煙1個月COPD組(P<0.05)。肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞所占比例在3組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組肺功能檢測結果

與正常對照組比較：1)P<0.05，下表同

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)及細胞分類

2.4NGF蛋白的表達 正常對照組、COPD組、戒煙1個月COPD大鼠血中NGF蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。相比正常對照組，COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液中NGF蛋白表達明顯升高，但兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組NGF蛋白在血、肺組織、支氣管肺泡灌洗液中的表達

2.5NGF mRNA的表達 COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠血中NGF mRNA表達分別是正常對照組的(1.76±0.25)倍及(1.34±0.15)倍，但3組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織及支氣管肺泡灌洗液中NGF mRNA分別是正常對照組的(24.76±5.99)倍、(25.32±5.45)倍及(23.34±3.50)倍、(26.32±7.45)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。COPD組與戒煙1個月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液NGF mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

目前根據COPD的致傷因素把COPD模型的建立方法分為單一因素誘導、復合因素誘導模型〔5〕。單一因素包括：吸入有毒、有害氣體(香煙煙霧、二氧化硫、氯化鎘等)〔6〕；氣管內注入豬胰彈性蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、LPS等化學藥物；鼻多次吸入肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌；基因調控模型〔7〕。復合因素建立在慢性煙霧暴露基礎上聯(lián)合氣管內注入蛋白酶或脂多糖〔8〕。關于采用何種動物模型，主要根據臨床上常見的誘因、研究目的、動物種屬和實驗條件決定。吸煙是導致COPD發(fā)生發(fā)展的最主要環(huán)境因素，90%的COPD患者為吸煙者，香煙煙霧中含有一氧化碳、氮氧化物、氨、丙烯醛、對苯二酚、煙堿、氫氰酸等在內的4 500多種化合物。吸入這些有害物質可以使氣道纖毛脫落、倒伏、不規(guī)則，纖毛運動發(fā)生障礙，降低局部清除能力，并直接損傷氣道上皮細胞，增加病毒及細菌的感染，引起支氣管痙攣，增加氣道阻力〔9〕，長期的煙霧刺激還使黏膜下腺體過度增生，杯狀細胞分泌過多，加強氣道阻塞，大量氧化劑和自由基可以激活巨噬細胞、T細胞(尤其是CD8+T細胞)、中性粒細胞在肺部浸潤，激活的這些炎性細胞分泌白細胞介素-1、白細胞介素8、腫瘤壞死因子等多種炎性因子及中性粒細胞蛋白酶、基質金屬蛋白酶、α-胰蛋白酶等蛋白酶類從而引起氣道、肺實質、肺血管的慢性炎癥和肺組織的破壞〔10〕。因此單一煙熏模型更符合COPD的發(fā)病過程和病理改變，被動吸煙可以誘導出最真實的COPD〔11〕，因此本實驗采用單一煙熏法建立COPD模型。

煙霧暴露的時間要長達數(shù)月〔12〕，如6個月或者更長時間可使肺氣腫形成越典型，可能是因為肺實質的修復相關的基因在香煙暴露3個月時明顯下降，6個月時下調更明顯，從而造成肺實質的破壞，形成肺氣腫〔9〕，其中以大鼠、小鼠、豚鼠最為常用。有研究顯示SD大鼠每天暴露于10支香煙的煙霧中，連續(xù)16 w，肺病理顯示肺氣腫形成，支氣管周圍及血管周圍炎性細胞浸潤，可以成功復制COPD模型〔13〕。若每次同時點燃5支香煙，每天暴露4次，每周6 d，連續(xù)80 d，肺功能及肺組織病理提示也可以成功建立COPD模型。若采用早晚各1次，每次1 h，1支香煙燃燒約15 min，間隔5 min，再燃燒另1支，每次共燃燒3支香煙的方法，連續(xù)36 w，24 w時成功復制肺氣腫及氣道重塑模型，但肺功能在36 w時才有統(tǒng)計學差異〔14〕。在臨床中，即使戒煙，COPD的炎癥仍繼續(xù)發(fā)展，肺功能仍在下降，建立戒煙后COPD模型利于對COPD發(fā)病機制的探討〔5〕。因此延長被動吸煙時間、加大煙霧刺激量，采用6個月單純煙煙熏法建立的COPD模型，即使戒煙，大鼠肺組織HE染色仍證實肺氣腫、肺大泡的形成，肺功能證提示氣流仍受限，支氣管灌洗液中炎性細胞持續(xù)浸潤，這對研究COPD發(fā)生發(fā)展的機制提供良好的動物模型。

體內外實驗證明NGF介導細胞的存活、增生、分化和活化。NGF在肺組織的結構細胞及炎性細胞有一定的基礎量表達，這有助于細胞的存活及生理功能的發(fā)揮〔15〕。有研究表明如果肺組織缺乏NGF受體，動物的早期死亡率升高，NGF可能通過上調bcl-2表達及激活核轉錄因子κB抑制單核細胞、肥大細胞、上皮細胞、B細胞的凋亡〔16〕。本實驗結果提示NGF持續(xù)參與COPD肺部炎性反應。

本實驗觀察到香煙刺激的大鼠氣管灌洗夜中中性粒細胞、巨噬細胞數(shù)目明顯增多，這與相關研究相同〔17〕。肺泡巨噬細胞強大的吞噬作用、抗原提呈能力，分泌及調節(jié)炎性因子和蛋白酶的功能在COPD發(fā)病中起到關鍵作用〔18〕，在COPD急性發(fā)作期，中性粒細胞浸潤增多〔19〕。研究表明NGF可以上調單核巨噬細胞表面趨化因子受體4，增強其趨化性。在脂多糖刺激下，單核巨噬細胞高表達NGF和TrkA，并呈濃度、時間依賴性，高表達的NGF通過結合單核細胞表面的TrkA激活ERK1/2及部分c-Jun氨基末端激酶上調腫瘤壞死因子-α表達，而預先用NGF抗體拮抗內源性NGF后，在脂多糖刺激下單核巨噬細胞凋亡明顯增多〔20〕。以上研究提示在急性炎癥時，NGF介導巨噬細胞的存活并調節(jié)功能的發(fā)揮。在我們前期研究發(fā)現(xiàn)，香煙刺激COPD大鼠肺泡巨噬細胞高表達NGF及其受體〔4〕，增多的NGF與受體TrkA結合是否介導肺泡巨噬細胞、中性粒細胞在肺部的存活及調控細胞功能，從而參與COPD的進程，這需要深入研究。