乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白1的表達(dá)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性

楊蘭艷，殷芳，鄭盛，王建剛

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南 昆明650000

胃癌是來(lái)源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，2018年全球癌癥報(bào)告顯示，全球因癌癥死亡的病例中，胃癌占8.2‰，位居世界惡性腫瘤死因的第2位，胃癌也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率及病死率，嚴(yán)重威脅著人們的健康［1］。用可行的檢測(cè)方法尋找可靠有效的胃癌分子標(biāo)志物，對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷、判斷預(yù)后和分子靶向藥物治療，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療是目前研究的重要任務(wù)之一［2］。

乳腺癌易感基因1（breast cancer gene 1，BRCA1）相關(guān)蛋白 1（BRCA1 associated protein 1，BAP1）是由BAP1基因編碼的一種去泛素化酶，BAP1可參與細(xì)胞生存、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)泛素化等多種功能的調(diào)控，BAP1與惡性間皮瘤、皮膚黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌和頭頸部鱗癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療預(yù)后相關(guān)［3］。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BAP1蛋白和mRNA在胃癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)，分析BAP1表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討B(tài)AP1在胃癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集整理2012年1月至2016年1月云南省第三人民醫(yī)院87例行手術(shù)切除的胃癌病人的胃癌及其癌旁組織標(biāo)本。癌旁組織取自手術(shù)切除殘端，距離癌組織大于5 cm，切緣陰性。所有病人術(shù)前及術(shù)后病理學(xué)檢查均確診為胃癌，術(shù)前均未行化療、放療以及其他特殊治療，臨床診療資料完整。所需組織切除離體后立即取材，標(biāo)本獲取后置于凍存管并立即保存在液氮中。胃癌診斷其及常規(guī)病理資料由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片后確診。術(shù)后分期方法采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第七版的分期標(biāo)準(zhǔn)。87例胃癌病人的年齡范圍為39～82歲，中位年齡為59歲；I期18例，Ⅱ期33例，Ⅲ期36例；全組病人均為腺癌，其中高分化15例，中分化27例，低分化45例；79例病人接受了術(shù)后放和或化療。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

病人術(shù)后出院，每3～6月隨訪一次，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀體征、全身體格檢查和影像學(xué)（B超、CT和MRI等）檢查。隨訪起始日為術(shù)后病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2019年2月21日，隨訪時(shí)間為3～84個(gè)月，中位隨訪時(shí)間42個(gè)月，無(wú)失訪病例。

1.2 主要儀器及試劑 組織樣品研磨儀購(gòu)于北京赫得科技有限公司，光學(xué)顯微鏡BX53購(gòu)于日本奧林巴斯公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thorlabs公司，BAP1兔多克隆抗體購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，免疫組化SP法試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）試劑盒購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)SP法（鏈霉菌抗生素蛋白－過(guò)氧化物酶）檢測(cè)87例胃癌病人胃癌及其癌旁組織的BAP1蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，用已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片均由兩位病理醫(yī)生分別評(píng)分，最終取平均值。結(jié)合細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度分為未染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色，分別記為0～3分；切片中陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為＜5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%和76%～100%，分別記為0～4分；兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘得到免疫反應(yīng)積分作為最終得分。BAP1蛋白表達(dá)的評(píng)分≤7分定義為低表達(dá)，≥8分定義為高表達(dá)［4，5］。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在全組87例胃癌病人中隨機(jī)選取32例采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量比較癌組織及其癌旁組織中BAP1 mRNA表達(dá)差異。將勻漿的組織參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取總RNA進(jìn)行檢測(cè)，然后參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明中的操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所有樣品做3個(gè)復(fù)孔［6］。相關(guān)的引物序列如下：內(nèi)參照GAPDH的正向引物序列為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，反向引物序列為 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；BAP1的正向引物序列為5′-GCTCGTGGAAGATTTCGGTGT-3′；反向引物序列為5′-TCATCAATCACGGACGTATCATC-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。BAP1表達(dá)水平與胃癌病人臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以s表示，胃癌組織及其癌旁組織中BAP1 mRNA表達(dá)的差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Kaplan-Meier法分析各組病人生存時(shí)間，并行Log-rank檢驗(yàn)，Cox回歸模型用于胃癌預(yù)后的多因素分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAP1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果表明BAP1主要存在于細(xì)胞核中，呈棕黃色。87例病人胃癌組織中，BAP1高表達(dá)34例（39.1%），低表達(dá)53例（60.9%）；87例癌旁組織中，BAP1高表達(dá)58例（66.7%），低表達(dá)29例（33.3%），BAP1蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝13.290，P＝0.000）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示32例胃癌病人癌組織BAP1 mRNA的表達(dá)明顯低于癌旁組織［（1.195±0.470）比（3.399±0.891）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝15.320，P＝0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白1 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 BAP1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系 BAP1蛋白的表達(dá)水平與胃癌病人的腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與性別、年齡、腫瘤大小和生長(zhǎng)方式無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白1表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征的相關(guān)性/例

2.3 BAP1表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的相關(guān)性 采用Kaplan-Meier法分析BAP1蛋白表達(dá)與病人生存期關(guān)系，全組87例胃癌病人的中位生存期41.2個(gè)月，3和5年生存年率分別為57.4%和41.2%，其中BAP1低表達(dá)組和高表達(dá)組病人3年生存率分別為45.2%和75.8%，5年生存率分別為27.6%和58.2%，與BAP1高表達(dá)組比較，低表達(dá)組病人的生存期明顯縮短，見(jiàn)圖2，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.392，P＝0.012），表明胃癌病人中BAP1低表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)深度（HR＝2.435，95%CI：1.453～4.328，P＝0.015）、TNM分期（HR＝3.242，95%CI：1.609～5.341，P＝0.008）、BAP1表達(dá)水平（HR＝1.712，95%CI：1.064～3.401，P＝0.020）是影響胃癌病人生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖2 乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白1（BAP1）表達(dá)水平與胃癌病人生存期的關(guān)系

3 討論

BAP1是一種由729個(gè)氨基酸組成的去泛素化酶，BAP1可與BRCA1的RING指狀結(jié)構(gòu)域的相互作用從而發(fā)揮生物學(xué)作用，BAP1可能通過(guò)調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的泛素化水平從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制尚未明確［7］。多項(xiàng)研究表明，BAP1在不同腫瘤中的作用不同。一項(xiàng)關(guān)于BAP1與葡萄膜黑色素瘤［8-9］、腎透明細(xì)胞癌［10-11］、膽管癌［12-13］、非小細(xì)胞肺癌［14］和結(jié)直腸癌［15］等多種惡性預(yù)后關(guān)系的薈萃分析結(jié)果顯示，BAP1作為腫瘤抑制基因在多數(shù)腫瘤中呈低表達(dá)，BAP1的表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，BAP1低表達(dá)病人惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，BAP1低表達(dá)與上述惡性腫瘤病人預(yù)后不良相關(guān)，BAP1低表達(dá)可增加病人的全因死亡率，腫瘤特異病死率和復(fù)發(fā)率，該研究還發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)分析探討B(tài)AP1對(duì)預(yù)后的影響是可行的，并推薦BAP1作為惡性腫瘤病理診斷的重要分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)［16］。另外，研究表明BAP1蛋白是惡性間皮瘤的可靠的診斷及預(yù)后標(biāo)志物，BAP1結(jié)合其他間皮瘤相關(guān)蛋白有助于鑒別惡性間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌［17-18］。BAP1低表達(dá)可降低惡性間皮瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性［19］，BAP1低表達(dá)的惡性間皮瘤病人預(yù)后欠佳。

與以上研究結(jié)論不同，有研究發(fā)現(xiàn)惡性間皮瘤BAP1低表達(dá)病人預(yù)后良好［20-21］。另有研究表明BAP1可能在皮膚黑色素瘤、頭頸部鱗癌和乳腺癌等腫瘤發(fā)生中發(fā)揮促癌作用。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究均表明BAP1可促進(jìn)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖和集落形成，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與BAP1誘導(dǎo)survivin蛋白表達(dá)有關(guān)［22］。Qin等［23］的研究發(fā)現(xiàn)BAP1可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子KLF5的去泛素化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、存活、遷移和腫瘤生長(zhǎng)。BAP1可能通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白H2Aub的去泛素化誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞放療抗拒，BAP1與頭頸部鱗癌病人的預(yù)后不良有關(guān)［24］。

目前BAP1在胃癌中的作用尚未明確。本研究免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與癌旁組織相比，BAP1在胃癌病人癌組織中呈低表達(dá)，為進(jìn)一步探討B(tài)AP1的表達(dá)水平與胃癌病人臨床預(yù)后的關(guān)系，我們分析了BAP1的表達(dá)與各種臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果表明BAP1低表達(dá)的病人腫瘤分化程度低，局部浸潤(rùn)明顯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，臨床分期晚，生存預(yù)后不良，BAP1的表達(dá)水平是影響胃癌病人生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但確切的研究結(jié)論及其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。