Bcl2相互作用蛋白3在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的意義

嚴(yán)必紅，曾為紅

作者單位：1武漢市第九醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430080；2武漢市漢口醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430010

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種好發(fā)于育齡期女性的婦科良性疾病，臨床特征主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛及不孕，影響著全球10%女性的身心健康［1］，且當(dāng)下并無切實(shí)有效的根治措施［2-3］。EMs癥狀有時不典型，目前其診斷金標(biāo)準(zhǔn)為腹腔鏡檢查，手術(shù)干預(yù)具有費(fèi)用昂貴以及術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。加上缺乏特異性的標(biāo)志物，使得EMs的診療極具挑戰(zhàn)性，因而探索這種疾病的發(fā)病機(jī)制尤為關(guān)鍵。作為一種良性疾病，EMs具有“惡性”生物行為，異位子宮內(nèi)膜組織具有較強(qiáng)的增殖、種植、轉(zhuǎn)移特性。有資料顯示，EMs可能具有惡性轉(zhuǎn)歸的跡象，特別是與卵巢癌的發(fā)生具有明顯相關(guān)性，嚴(yán)重威脅著病人的生命健康［4］。異位種植內(nèi)膜的惡性傾向可能與內(nèi)膜所處環(huán)境的變化相關(guān)，更可能是由于腫瘤相關(guān)基因的變化導(dǎo)致了其惡性行為的發(fā)生以及疾病的發(fā)展［5］。

細(xì)胞凋亡通過在分泌期和月經(jīng)期清除子宮內(nèi)膜功能層的衰老細(xì)胞來維持月經(jīng)周期中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，子宮內(nèi)膜組織自發(fā)性凋亡信號的正常進(jìn)行是內(nèi)膜周期性脫落的關(guān)鍵［6］。異位的子宮內(nèi)膜得以在宮腔外進(jìn)行種植、轉(zhuǎn)移，離不開其增殖能力的增強(qiáng)以及凋亡能力的減弱［7-8］。Bcl2相互作用蛋白3（BCL2 Interacting Protein 3，BNIP3）是 Bcl-2蛋白家族中BH3-only亞家族的成員之一，它能夠同抗凋亡因子E1B及BCL2相互作用發(fā)揮促凋亡的功能［9］。BNIP3在調(diào)節(jié)線粒體自噬、凋亡、腫瘤的發(fā)生以及缺氧性損傷疾病中具有重要價值［10-14］。本研究通過生物信息學(xué)手段分析正常女性以及EMs病人子宮內(nèi)膜組織增殖期及分泌期基因表達(dá)變化以及BNIP3在各組織中的表達(dá)，通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，結(jié)合臨床病例檢測正常女性子宮內(nèi)膜組織以及EMs病人正位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜中BNIP3的表達(dá)差異，擬闡明BNIP3表達(dá)變化在正常月經(jīng)周期的維持以及在EMs發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取公共數(shù)據(jù)庫GEO中數(shù)據(jù)集GSE51981、GSE6364、GSE4888、GSE25628進(jìn)行生物信息學(xué)分析。臨床病例選取2017年8月至2019年1月于武漢市第九醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的EMs病人23例，年齡范圍為27～41歲，月經(jīng)規(guī)律，手術(shù)證實(shí)為EMsⅣ型或Ⅳ型（按美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法”分型）。對病人同時行宮腔鏡檢查，診刮得到子宮內(nèi)膜組織，術(shù)中取異位內(nèi)膜組織。選同期就診的行子宮全切的子宮肌瘤病人25例，年齡范圍為33～47歲，術(shù)后立即取病人子宮內(nèi)膜組織。以上標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實(shí)均處于子宮內(nèi)膜增殖期，組織獲取后立即放入液氮，后轉(zhuǎn)入-80℃保存。排除術(shù)前6個月使用激素、內(nèi)分泌疾病病人，排除其他惡性腫瘤病人。研究取材獲得病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 分子生物學(xué)研究

1.2.1 主要試劑及儀器 總RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒（Takara，日本）；PCR引物（生工生物，上海）；BCA蛋白定量試劑盒（雷根生物，北京）；GAPDH單克隆抗體（Santa Cruz，美國）；BNIP3多克隆抗體（CST，美國）。紫外光分光光度計（尤尼柯，上海）；實(shí)時定量PCR儀（ABI 7500，美國）；酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（LICOR，美國）。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR 取出凍存組織在液氮中進(jìn)行研磨，按照總RNA提取試劑說明抽提總RNA，RNA的含量及純度通過紫外分光光度計測定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，置于實(shí)時定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。BNIP3及GAPDH引物序列如下：BNIP3，正向引物5′-AGGGCTCCTGGGTAGAACT-3′；反向引物 5′-CTCCATTATAAATAGAAACCGAGGC-3′。GAPDH，正向引物5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATA-3′，反向引物5′-CATCGCCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3′。RT-PCR反應(yīng)體系：1 μl cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上反向引物各1 μL（10 μmol/L），設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s，以95℃ 5 s，60℃ 34 s進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)末進(jìn)行熒光檢測，循環(huán)結(jié)束后測量熔解曲線。測定各樣本BNIP3及GAPDH的Ct值后，用2-△△Ct值分析mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測 凍存組織液氮研磨、裂解后提取總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。每樣本取30 μg總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)后，濕式法電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫下脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗，4℃孵育過夜。第二天漂洗后，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的二抗，室溫下孵1 h，置于成像系統(tǒng)中掃描并分析。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 材料獲取及數(shù)據(jù)處理 在GEO數(shù)據(jù)庫中以“endometrium，endometriosis”為檢索詞，可獲得多組與EMs相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，本研究將編號為GSE51981、GSE6364、GSE4888、GSE25628的芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)納入研究對象，分析內(nèi)膜組織中增殖期及分泌期基因的表達(dá)變化及BNIP3表達(dá)量。

1.3.2 資料分組 GSE51981數(shù)據(jù)集研究對象為不同子宮內(nèi)膜周期的正常及EMs病人的子宮內(nèi)膜組織，將該芯片的研究對象分為正常子宮內(nèi)膜組增殖期組、正常子宮內(nèi)膜組分泌期組、EMs增殖期組、EMs分泌期四組；GSE6364數(shù)據(jù)集研究對象為不同子宮內(nèi)膜周期的正常及EMs病人的子宮內(nèi)膜組織，將該芯片的研究對象分為正常子宮內(nèi)膜組增殖期組、正常子宮內(nèi)膜組分泌期組、EMs增殖期組、EMs分泌期四組；GSE4888研究對象為正常子宮內(nèi)膜組群不同子宮內(nèi)膜周期的子宮內(nèi)膜組織，將該芯片研究對象分為正常子宮內(nèi)膜組增殖期組、正常子宮內(nèi)膜組分泌期組兩組；GSE25628研究對象為重度EMs病人子宮內(nèi)膜正位及異位內(nèi)膜組織以及正常人子宮內(nèi)膜組織，將其分為正常人子宮內(nèi)膜組、EMs正位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組三組，分別進(jìn)行比較。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析 采用R語言中GEOquery、affy、Biobase、limma、ggplot2等軟件包進(jìn)行差異基因篩選，差異基因（DEGs）篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log（FC）|＞1.5，P＜0.05。使用Funrich（http：//www.funrich.org）軟件進(jìn)行基因篩選，基因的功能富集分析通過DAVID在線網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）以及R語言中org.Hs.eg.db、clusterProfiler以及DOSE軟件包進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，通過Graphpad Prisms 5.0進(jìn)行圖形繪制。計量資料以s表示，兩組間比較采用Student-t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way ANOVA并進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常子宮內(nèi)膜組織中增殖期到分泌期的基因表達(dá)變化及BNIP3表達(dá) 從GEO數(shù)據(jù)庫中選取數(shù)據(jù)集GSE4888、GSE6364、GSE51981進(jìn)行原始數(shù)據(jù)提取進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，在數(shù)據(jù)集GSE4888中，BNIP3在增殖期相對表達(dá)量為（100.22±16.54）（n＝4），分泌期相對表達(dá)量為（332.80±32.29）（n＝3），兩組對比t＝12.63，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在數(shù)據(jù)集GSE6364中，BNIP3在增殖期相對表達(dá)量為（487.68±100.09）（n＝5），分泌期相對表達(dá)量為（1 425.83±157.47）（n＝3），兩組對比t＝10.51，P＜0.000 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在數(shù)據(jù)集GSE51981中，BNIP3在增殖期相對表達(dá)量為（8.36±0.69）（n＝35），分泌期相對表達(dá)量為（9.82±0.71）（n＝12），兩組對比t＝6.26，P＜0.000 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 正常增殖期到分泌期上調(diào)基因富集分析 我們進(jìn)一步對數(shù)據(jù)集GSE4888、GSE6364、GSE51981中正常內(nèi)膜分泌期表達(dá)增高的基因進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示三個數(shù)據(jù)集富集結(jié)果基本一致，較顯著的富集模塊有細(xì)胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)、銅離子的解毒作用、金屬離子的應(yīng)力響應(yīng)、無機(jī)物的解毒作用、脂肪酸衍生物生物合成工藝、前列腺素生物合成的過程等。

2.3 正常人與EMs病人子宮內(nèi)膜組織中增殖期到分泌期基因表達(dá)變化差異 從GEO數(shù)據(jù)庫中選取數(shù)據(jù)集GSE51981、GSE6364進(jìn)行原始數(shù)據(jù)提取，采用 R 語言中 GEOquery、affy、Biobase、limma、ggplot2織與EMs病人正位子宮內(nèi)膜組織增殖期到分泌期基因表達(dá)變化差別，差異基因（DEGs）篩選標(biāo)準(zhǔn)為等軟件包進(jìn)行差異基因篩選，分析正常子宮內(nèi)膜組|log（FC）|＞1.5，P＜0.05。結(jié)果顯示在GSE51981數(shù)據(jù)集中，正常人群子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期表達(dá)升高的基因有341個；EMs病人子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期表達(dá)升高的基因有379個；在GSE6364數(shù)據(jù)集中，正常人群子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期表達(dá)升高的基因有841個；EMs病人子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期表達(dá)升高的基因有324個；同一分組中基因表達(dá)變化趨勢并不完全一致，本研究對兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行綜合分析，共有83個基因在正常人內(nèi)膜組織中從增殖期到分泌期表達(dá)增高（含缺失值3個），且在EMs病人內(nèi)膜組織中表達(dá)并未增高。進(jìn)一步對差異表達(dá)的基因進(jìn)行表達(dá)量分析，差異基因列表見表1。

2.4 BNIP3在EMs病人子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)變化 從GEO數(shù)據(jù)庫中選取數(shù)據(jù)集GSE25628進(jìn)行原始數(shù)據(jù)提取，病理選取均為增殖期內(nèi)膜組織，采用R語言中GEOquery、affy、Biobase等軟件包進(jìn)行基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)提取，進(jìn)一步分析EMs病人正位及異位子宮內(nèi)膜組織中BNIP3的表達(dá)變化。BNIP3在正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人正位、EMs病人異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量分別為（10.11±0.72）（n＝6）、（9.19±0.56）（n＝9）、（8.52±0.57）（n＝7），三組間對比F＝10.976，P＝0.001。進(jìn)一步Turkey檢驗(yàn)顯示正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人正位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量差異P＝0.026，正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量差異P＜0.000，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 BNIP3 mRNA在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平 對收集的病例進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示：在正常及EMs病人正位及異位內(nèi)膜組織中均有BNIP3 mRNA的表達(dá)，正常內(nèi)膜組織、EMs正位內(nèi)膜組織中BNIP3的mRNA表達(dá)量分別為1.15±0.57、0.56±0.19、EMs異位內(nèi)膜組織中表達(dá)量為0.36±0.08，三組間對比F＝31.428，P＜0.001，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步Turkey檢驗(yàn)顯示正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人正位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量差異P＜0.001，正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量差異P＜0.001，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 BNIP3蛋白在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平 對收集的病例進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析，結(jié)果如圖2所示。以正常內(nèi)膜組織為對照，BNIP3蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、EMs正位內(nèi)膜組織、EMs異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平分別為1.00±0.41、0.58±0.20、0.38±0.12。三組間對比F＝31.322，P＜0.001，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步Turkey檢驗(yàn)顯示正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人正位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量有差異（P＜0.001），正常子宮內(nèi)膜組織、EMs病人異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量有差異（P＜0.001），均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 Bcl2相互作用蛋白3（BNIP3）在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)

3 討論

在哺乳動物中，線粒體在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。凋亡反應(yīng)啟動時，Bcl-2蛋白及與其相關(guān)的凋亡信號分子Bax、Bak等相互作用，順勢切割激活Caspase3及Caspase9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。凋亡是細(xì)胞保持正常周期性及功能穩(wěn)定的關(guān)鍵，子宮內(nèi)膜周期性的變化伴隨著內(nèi)膜細(xì)胞凋亡信號的改變。月經(jīng)規(guī)則的子宮內(nèi)膜周期包括增殖期、分泌期及月經(jīng)期三個時期，增殖期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，有助于子宮內(nèi)膜的增殖；晚期分泌期及月經(jīng)期中，細(xì)胞凋亡信號增強(qiáng)、抗凋亡能力減弱，細(xì)胞凋亡的發(fā)生有助于通過消除子宮內(nèi)膜功能層的衰老細(xì)胞來維持月經(jīng)周期的正常進(jìn)行，其中Bcl-2相關(guān)凋亡信號的調(diào)節(jié)在此過程中具有重要作用［6］。

EMs病人內(nèi)膜組織中的凋亡信號發(fā)生變化，抗凋亡相關(guān)信號在EMs病人增殖期子宮內(nèi)膜組織特別是異位子宮內(nèi)膜組織中異常增高［15］，細(xì)胞凋亡信號的改變與疾病的發(fā)生發(fā)展以及異位內(nèi)膜種植及轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)具有相關(guān)性。EMs是一種雌激素依賴性的疾病，研究顯示促性腺激素釋放激素能夠通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡發(fā)揮治療效果［15］。細(xì)胞凋亡信號的改變及干預(yù)在EMs的發(fā)生及防治中具有重要作用，發(fā)現(xiàn)及探索子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡機(jī)制及調(diào)節(jié)EMs發(fā)生的凋亡分子具有重要價值。

BNIP3可以與Bcl-2和腺病毒E1B相互作用的發(fā)揮促凋亡功能。其N末端具有BH3結(jié)構(gòu)域，與其誘導(dǎo)線粒體自噬關(guān)系密切；C末端含有TM結(jié)構(gòu)域，使其定位在線粒體外膜，與其凋亡調(diào)節(jié)功能相關(guān)。BNIP3除可直接同Bcl-2形成異二聚體發(fā)揮促凋亡功能外，還可以打開線粒體上H+通道，導(dǎo)致促進(jìn)線粒體去極化而發(fā)揮促凋亡作用［16］。正常生理?xiàng)l件下，BNIP3表達(dá)水平較低，但在惡性腫瘤如肺癌、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌中的表達(dá)水平均較高。作為低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α可以直接調(diào)控的靶基因，BNIP3在缺血缺氧環(huán)境中可高表達(dá)于線粒體外膜上，HIF-1α/BNIP3調(diào)控機(jī)制可能與BNIP3在癌癥及缺血缺氧性疾病中的調(diào)節(jié)作用相關(guān)［17］。

月經(jīng)的發(fā)生是由于子宮螺旋動脈收縮導(dǎo)致的內(nèi)膜缺血缺氧進(jìn)而壞死脫落，BNIP3對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用可能與正常內(nèi)膜的脫落及異位內(nèi)膜的種植、轉(zhuǎn)移相關(guān)。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)手段分析BNIP3在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與增殖期內(nèi)膜相比，BNIP3在分泌期子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)增高，這與以往研究所表明的分泌期內(nèi)膜凋亡增多相一致。在EMs病人中，BNIP3在分泌期雖然也有所增多，但是其變化程度明顯低于正常對照組。我們進(jìn)而對比EMs病人正位及異位內(nèi)膜組織，結(jié)果顯示BNIP3在EMs病人內(nèi)膜中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，該現(xiàn)象在異位內(nèi)膜組織與正常子宮內(nèi)膜組織的比較重更為明顯。但是芯片數(shù)據(jù)GSE25628結(jié)果分析并未顯示EMs病人正位及異位內(nèi)膜中BNIP3的表達(dá)有明顯差異。

我們進(jìn)一步檢測了于本單位收集的23例EMs病人的正位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織，以及以同期無EMs的25例病人正常內(nèi)膜組織為對照，比較BNIP3在各樣本中的表達(dá)。為保證收集到的異位內(nèi)膜組織的準(zhǔn)確率以及實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性以及可比性，我們納入病例為Ⅲ～Ⅳ期的子宮內(nèi)膜病人。結(jié)果顯示，EMs病人正位及異位子宮內(nèi)膜組織中BNIP3 mRNA的表達(dá)均明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，但其在EMs正位及異位內(nèi)膜中的表達(dá)無明顯差異；蛋白水平檢測顯示，EMs病人正位及異位子宮內(nèi)膜組織中BNIP3蛋白的表達(dá)均明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，且其在EMs異位內(nèi)膜中的表達(dá)低于正位內(nèi)膜組織。以上分析顯示BNIP3的表達(dá)變化在子宮內(nèi)膜功能調(diào)節(jié)中具有重要意義，在更大范圍內(nèi)進(jìn)行檢測以及更深層次的探索BNIP3在EMs發(fā)病中的作用，進(jìn)而通過調(diào)控其表達(dá)干預(yù)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，有助于為EMs的治療提供新的思路或治療方案。