全反式維甲酸對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞間隙連接通信的影響

梁曉冬 鄧新華 李春紅 梁景耀 張錫寶

1暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院，佛山，528305；2廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所/廣州市皮膚病防治所，廣州，510095

細(xì)胞中的間隙連接通訊(GJIC)是在多細(xì)胞生物體中普遍存在的通信模式，其功能由連接蛋白(Cx)實(shí)現(xiàn)。目前有關(guān)連接蛋白43(Cx43)研究較多，并顯示了與銀屑病的相關(guān)性。全反式維甲酸(ATRA)對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞間GJIC功能的影響及可能作用的途徑仍然未知，進(jìn)一步探究ATRA與銀屑病中GJIC關(guān)系，將加深對(duì)細(xì)胞GJIC功能的理解，并為增強(qiáng)藥物作用或敏感性及銀屑病治療指出了新的方向。

1 細(xì)胞間隙連接通訊

1.1 間隙連接通訊結(jié)構(gòu) 間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication, GJIC)是在多細(xì)胞生物體中廣泛存在的溝通模式，并且其生物效應(yīng)是通過間隙連接(gap junction, GJ)來實(shí)現(xiàn)的。六個(gè)單元的連接蛋白(connexin, Cx)聚集體形成連接子或半通道，連接子布置在細(xì)胞膜形成親水性管道，嵌入在細(xì)胞質(zhì)中，相鄰區(qū)域細(xì)胞的兩個(gè)中央小管連接形成GJ通道[1]。大分子物質(zhì)如脂類、遺傳物質(zhì)、多糖等不能通過間隙連接通道被輸送，但小分子物質(zhì)如離子、核苷酸、第二信使細(xì)胞因子等可以通過間隙連接通道[2]。間隙連接會(huì)受到各種分子對(duì)Cx蛋白構(gòu)象的各種影響，間隙連接狀態(tài)從而發(fā)生改變[3]。

1.2 連接蛋白表達(dá)與定位 關(guān)于連接蛋白26、連接蛋白30、連接蛋白43(Cx26、Cx30、Cx43)的研究較多，它們?cè)诮琴|(zhì)形成細(xì)胞中作用較為突出[4]。單細(xì)胞或多細(xì)胞生物的體內(nèi)生命活動(dòng)的功能和平衡由細(xì)胞外囊泡、隧道納米管或GJ介導(dǎo)。最近的研究表明，Cx43可參與以上所有細(xì)胞間介導(dǎo)形式的交流[5]。已有學(xué)者證明，Cx26和Cx43共定位/表達(dá)于一些角質(zhì)形成細(xì)胞上，銀屑病損傷表皮和陰道上皮的雙重染色顯示兩種連接蛋白的表達(dá)可部分重疊，某些區(qū)域顯示Cx26蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，或Cx43蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)。Cx26和Cx43經(jīng)常聚集出現(xiàn)在同一細(xì)胞膜上。涉及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分化的大多數(shù)研究集中強(qiáng)調(diào)Cx26和Cx43[4]，同樣銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞膜中的個(gè)別大連接間隙可同時(shí)含有Cx26和Cx43[6]。Cx26在銀屑病等增生性表皮的基底和基底上角質(zhì)形成細(xì)胞中與Cx43共表達(dá)，并且Cx43已被認(rèn)為可影響GJIC變化并誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[7]。

2 銀屑病與細(xì)胞間隙連接通訊

2.1 銀屑病發(fā)病機(jī)制及相關(guān)因子 銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性的皮膚病，部分患者具有家族易感史或明確家族史，通常受遺傳和環(huán)境雙重影響，T淋巴免疫細(xì)胞參與介導(dǎo)[8]。目前為止，銀屑病的確切病因和發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究，組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為角化過度、Munro微膿腫、T細(xì)胞浸潤(rùn)、真皮乳頭的血管擴(kuò)張[9，10]。有日漸增多的證據(jù)表明，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化以及免疫系統(tǒng)的活化與銀屑病密切相關(guān)[11]。角質(zhì)形成細(xì)胞如果出現(xiàn)一系列改變，包括增殖異常、終末分化能力降低、分化成熟周期縮短等，可能誘發(fā)銀屑病損害的病理變化。白介素22(interleukin-22, IL-22)、IL-23、IL-17，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)都是與銀屑病相關(guān)聯(lián)的主要炎性分子[12]。促使炎癥的細(xì)胞分子如多種白介素、腫瘤壞死因子、干擾素等，以及Th1和Th17免疫細(xì)胞，是在mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)Cx43、抑制GJIC功能的主要因素[13-15]。IL-22主要由Th1和Th17細(xì)胞分泌并且能夠增強(qiáng)這些細(xì)胞因子對(duì)銀屑病發(fā)病的影響[16]。 IL-22和這些細(xì)胞因子很可能在這期間通過一些共同的潛在機(jī)制下調(diào)Cx43來影響銀屑病活動(dòng)和GJIC的減少。

2.2 銀屑病中連接蛋白變化探究 斑塊狀銀屑病中Cx26和Cx30蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，銀屑病的易感性與表皮分化有關(guān)，包括E-鈣黏蛋白和Cx43的下調(diào)以及Claudin13的增強(qiáng)表達(dá)，Claudin13是表皮緊密連接的關(guān)鍵組分[17]。早期研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病斑塊含有大量的Cx43，這是一種間隙連接蛋白，可以出現(xiàn)在正常的人類表皮中。這種蛋白質(zhì)在銀屑病中的含量略高于對(duì)照皮膚，無論是判斷為轉(zhuǎn)錄水平(northern blot)還是蛋白質(zhì)水平(免疫熒光)[18]。以上研究似乎表明了此類連接蛋白的表達(dá)升高與銀屑病皮損加重程度有關(guān)，但仍然存在結(jié)果不同的研究。Liang等[19]研究旨在探討Cx43是否在銀屑病的表皮和IL-22處理的HaCaT細(xì)胞中失調(diào)。4例銀屑病患者的皮膚標(biāo)本中的Cx43蛋白表達(dá)分別用免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫熒光(IF)、qRT-PCR和Western印跡評(píng)估。 IHC和IF染色顯示Cx43蛋白表達(dá)主要定位于表皮基底層，并且病變中的信號(hào)顯著低于三個(gè)銀屑病患者的非損傷皮膚。然而，在一例銀屑病患者中，皮損中的Cx43蛋白表達(dá)信號(hào)略微降低。此外，qRT-PCR和Western印跡顯示出類似的結(jié)果。

3 全反式維甲酸藥物機(jī)制及應(yīng)用

3.1 全反式維甲酸代謝 全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)亦名全反式維A酸，是維甲酸(retinoic acid, RA)中一員，屬于第一代視黃酸藥物和維生素A(視黃醇)的天然代謝產(chǎn)物，并且作為干細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)劑。ATRA通過單純彌散的方式進(jìn)入細(xì)胞，之后主要分為兩條代謝途徑。一方面，它被結(jié)合到RA 結(jié)合蛋白I(cellular retinoic acid binding protein, CRABP I)上，隨即被輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)微粒體內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450 isoform 26, CYP26)分解消化，變成無活性產(chǎn)物；另一方面，ATRA被結(jié)合到結(jié)合蛋白II(cellular retinoic acid binding protein, CRABP II)上，后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步與各種細(xì)胞核受體結(jié)合，繼而影響轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等多種生命活動(dòng)。細(xì)胞色素P450酶亞型共有三種，分別為CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1，起調(diào)控體內(nèi)RA濃度水平的作用[20]。

3.2 全反式維甲酸受體 目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有兩種類型的核類視黃醇受體，一種是視黃酸受體(retinoid acid receptor, RAR)，而另一種是類視黃醇X受體(retinoid x receptor, RXR)，其中每種受體具有不同亞型(α，β，γ)，每個(gè)亞型具有若干種結(jié)構(gòu)[21]。視黃酸受體通過與維甲酸結(jié)合蛋白結(jié)合激活，誘導(dǎo)直接基因組靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄。RA誘導(dǎo)的機(jī)制是建立穩(wěn)固的RAR的直接或主要靶標(biāo)。簡(jiǎn)言之，RAR /RXR異二聚體與基因組維甲酸反應(yīng)元素(retinoic acid response elements,RAREs)相關(guān)聯(lián)，與RA配體的結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，取代阻遏物并有利于共激活劑的募集。此外，RA的主要靶標(biāo)還可以誘導(dǎo)第二靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞可以存在多種階段，比如細(xì)胞增殖、凋亡和分化，應(yīng)答于環(huán)境線索的多種改變[22]。

3.3 全反式維甲酸應(yīng)用 口服或局部使用RA的作用包括細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的雙向調(diào)節(jié)、抑制角質(zhì)化過程、參與調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)、抗炎癥反應(yīng)、抑制和滅活痤瘡丙酸桿菌、阻斷化學(xué)致癌過程等作用，尤其是對(duì)改善難治性角化性皮膚病、慢性光化性皮膚病和改善皮膚腫瘤進(jìn)程等提供了新的治療方法[23,24]。

4 全反式維甲酸對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊影響

4.1 全反式維甲酸影響細(xì)胞增殖遷移 ATRA已顯示出影響細(xì)胞增殖遷移的能力。ATRA以一定劑量和時(shí)間依賴方式，顯著減少血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖，并降低其遷移。這種RA活性伴隨著VSMC 中新型C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子(ZFP580)的上調(diào)。ATRA與RARα結(jié)合通過PI3K/AKT和ERK途徑誘導(dǎo)ZFP580表達(dá)[25]。此外，已有研究表明ATRA抑制白血病骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期過程，阻止細(xì)胞生長(zhǎng)并促使細(xì)胞凋亡增多，可能機(jī)制是Cx43表達(dá)的上調(diào)和GJIC功能的加強(qiáng)[26]。與其他類固醇激素一樣，ATRA通過核受體維甲酸受體(RARs)和非基因組引起基因組作用行動(dòng)。有研究確定細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白1 (Crabp1)介導(dǎo)RA的非基因組活性，并識(shí)別兩個(gè)化合物作為Crabp1的配體，能夠快速且獨(dú)立地激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)[27]。

4.2 全反式維甲酸對(duì)連接蛋白的作用 ATRA已顯示在多種不同類型細(xì)胞中上調(diào)Cx43表達(dá)和GJIC的功能[26,28]，盡管在NTera2/克隆D1細(xì)胞[29]和p19胚胎癌細(xì)胞中報(bào)道了一些相反的結(jié)果[30]。除了增加Cx43表達(dá)水平外，RA還通過增強(qiáng)蛋白磷酸酶2A和Cx43之間的相互作用來上調(diào)Cx43的去磷酸化，導(dǎo)致原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中GJIC的增加[31]。已發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)的磷酸化[28]以及Cx43的泛素化[32]可導(dǎo)致GJIC降低。雖未有研究報(bào)道RA對(duì)Cx43泛素化的直接影響，但已有研究顯示原發(fā)性急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中的泛素樣修飾物激活酶3控制細(xì)胞周期進(jìn)程中許多重要蛋白質(zhì)活動(dòng)，RA治療增加了其降解[33]。已經(jīng)充分證明RA不僅抑制細(xì)胞增殖和遷移，而且通過Cx43介導(dǎo)的GJIC增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗癌療法的敏感性[34,35]。

4.3 全反式維甲酸對(duì)IL-22和細(xì)胞間隙連接通訊影響 IL-22屬于白細(xì)胞介素10亞群，可以被先天性和后天性免疫系統(tǒng)激活。IL-22升高往往可見于銀屑病、間質(zhì)性肺病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，它們都屬于T淋巴細(xì)胞參與的疾病[36]。角質(zhì)形成細(xì)胞在IL-22的作用下，一方面可增強(qiáng)分泌多種微生物肽能力，另一方面自身分化、遷移能力也可被抑制[37]。體外研究表明，IL-22向上皮角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，并促使細(xì)胞增殖和遷徙。IL-22的信號(hào)傳導(dǎo)途徑經(jīng)過IL-22、IL-22R1和IL-10R2三元復(fù)合物模型發(fā)揮作用[38]。目前已知，人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)在IL-22的作用下，細(xì)胞增殖活躍且凋亡減弱[39]。有學(xué)者把IL-22注射到小鼠耳后細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮棘層增厚，而在基因敲除小鼠中未觀察到上述表現(xiàn)；銀屑病患者損害區(qū)域中IL-22的表達(dá)顯著高于普通人群組，在同一對(duì)應(yīng)的銀屑病患者中，從病變區(qū)分離出的T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-22水平高于外周血來源的T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-22水平[40]。人體、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型中均有證據(jù)支持，IL-22可促使細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡，在銀屑病中呈現(xiàn)高表達(dá)水平并加重自身炎癥和皮損癥狀。

IL-22BP是可溶性抑制性IL-22受體，可能是IL-22的重要調(diào)控因子。在人類中，未成熟的單核細(xì)胞來源DC(MDDC)可由維生素A酸誘導(dǎo)并表達(dá)IL-22BP，從而積極參與腸道IL-22活性的調(diào)節(jié)[36]。IL-22是銀屑病致病過程重要的因素，說明ATRA確實(shí)通過某些途徑對(duì)IL-22起抑制的作用。Liang等[19]研究表明，IL-22下調(diào)HaCaT細(xì)胞中的Cx43蛋白表達(dá)并降低GJIC功能，并經(jīng)過激活JNK傳導(dǎo)路徑刺激小鼠模型中的銀屑病樣改變。ATRA治療銀屑病的療效已被證實(shí)，靶向IL-22也可能是治療斑塊型銀屑病的一種潛在的治療方法。換言之，ATRA作為治療劑，它可影響某些細(xì)胞的遷移增殖，可使細(xì)胞間連接蛋白Cx43表達(dá)水平和GJIC功能強(qiáng)弱發(fā)生變化。ATRA對(duì)于人體表皮細(xì)胞的增殖遷移的影響尚未闡明。另一方面，IL-22作為重要的致炎因子，也已有證據(jù)支持它具有調(diào)節(jié)連接蛋白和細(xì)胞間連接通訊的能力。迄今未知ATRA在人體內(nèi)發(fā)揮作用過程中，是否涉及到IL-22這個(gè)關(guān)鍵因素。ATRA與IL-22之間可能存在某種聯(lián)系，它們之間的途徑機(jī)制值得進(jìn)一步探究。目前已知與銀屑病有關(guān)的通路較多，包括有JAK-STAT、Wnt、p38、JNK、AKT和ERK1/2通路等[41,42]，而ATRA對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞間GJIC功能的影響及可能作用的途徑仍然未知。

5 小結(jié)

目前研究發(fā)現(xiàn)，ATRA對(duì)多種細(xì)胞間GJIC功能產(chǎn)生影響，但其對(duì)銀屑病表皮細(xì)胞中GJIC功能作用仍然未明。IL-22可影響HaCaT細(xì)胞中Cx43和GJIC變化，人體內(nèi)環(huán)境的變化是多種綜合因素作用的共同結(jié)果，在銀屑病發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸不同過程中，ATRA、IL-22系統(tǒng)變化和其余未知因素可能參與共同作用。進(jìn)一步探究ATRA與銀屑病中GJIC關(guān)系，將拓展和增強(qiáng)細(xì)胞間隙連接通訊功能藥物、增強(qiáng)藥物敏感性的理解，并為銀屑病治療指出新思路。