血必凈注射液對老年重癥急性胰腺炎患者外周血單核細胞NLRP3炎性小體表達的影響

夏炳杰 強占榮 李桂鮮 秦振梅 駱雪萍

(桂林醫學院第二附屬醫院重癥醫學科，廣西 桂林 541199)

有研究報道，有15%～25%的急性胰腺炎可進展為重癥急性胰腺炎(SAP)，其死亡率高達20%～50%，特別是對于老年患者，死亡率可進一步升高〔1，2〕。研究顯示，炎癥通路的激活與SAP的發生、發展密切相關，相關炎性細胞因子如白細胞介素(IL)-8、γ干擾素及腫瘤壞死因子(TNF)-α等水平與其病情嚴重程度密切相關，同時可有效的評估預后〔3〕。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP3)炎性小體是免疫炎癥反應的重要組成部分，參與了眾多炎癥性疾病如器官缺血再灌注損傷、慢性阻塞性肺疾病及動脈粥樣硬化等疾病的發生、發展過程〔4～6〕。研究顯示，NLRP3炎性小體可協同NF-κB的激活，促進及放大急性胰腺炎的炎癥瀑布效應，引起大量促炎細胞因子的合成與分泌，而抑制NLRP3炎性小體，可顯著降低炎癥反應，阻止急性胰腺炎的進展〔7〕。目前，中醫藥已廣泛運用于急性胰腺炎的臨床治療，如血必凈注射液在調節免疫、抑制炎癥反應方面發揮重要作用，可顯著提高急性胰腺炎患者臨床療效〔8〕。本研究探討血必凈注射液對老年SAP患者NLRP3炎性小體表達的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年1月至2018年12月于桂林醫學院第二附屬醫院就診住院的老年SAP患者100例作為研究對象，其中男58例，女42例，年齡61～80歲，中位年齡70.5歲。致病原因：膽囊及膽管結石(40例)；暴飲暴食及酒精性(31例)；高脂血癥(10例)；藥物性(7例)；自身免疫性(6例)及其他(6例)；納入標準：患者均符合SAP診斷與治療指南〔9〕；年齡≥60歲。排除標準：合并惡性腫瘤、其他部位嚴重感染的患者；合并嚴重肝腎功能不全的患者；存在其他自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；對研究藥物過敏的患者。根據治療方法的不同，將上述患者按隨機數字表法，分為對照組(50例)和觀察組(50例)。兩組間在性別、年齡、病程、致病原因等方面無統計學差異(P>0.05)。本研究獲得了桂林醫學院第二附屬醫院倫理委員會的批準并征得了患者家屬書面知情同意。

1.2主要設備及試劑 主要設備：熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司)；主要試劑：人淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)；反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(Takara公司)；Western印跡相關試劑盒,如二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)；人血清IL-1β和IL-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(中國博士德公司)；內毒素ELISA檢測試劑盒(南京GenScript公司)；抗NLRP3、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1單克隆抗體(美國Abcam公司)；抗甘油醛-2-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國Santa公司)。

1.3治療方法 入院后對照組患者給予嚴格禁食禁水，留置胃管，給予補液用以維持機體水、電解質和酸堿平衡，抑制胰酶分泌，提供靜脈營養并給予持續血液灌流等治療。觀察組在對照組治療的基礎上加用血必凈注射液(天津紅日藥物公司，批準文號：國藥準字Z20040033，規格10 ml/支)，每次100 ml，每天2次，連用1 w。

1.4觀察指標

1.4.1一般臨床資料采集 記錄患者一般臨床資料如年齡、性別、基礎疾病等，同時記錄患者治療前后修正CT嚴重指數評分(MCTSI)、Ranson評分及APACHEⅡ評分。

1.4.2分離外周血單個核細胞(PBMCs) 取兩組患者治療前后靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，按照1∶1比例與人外周血淋巴細胞分離液混勻后離心，分離PBMCs，將1 ml Trizol加入PBMCs中混勻后備用。

1.4.3qRT-PCR檢測炎性小體NLRP3及Caspase-1 mRNA水平 運用Trizol法提取各組治療前后PBMCs總RNA，測定RNA濃度，然后按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。其中qPCR引物由上海生工公司設計合成，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；Caspase-1上游引物：5′-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTCCACATCACAGGAACA-3′；內參GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。依據TaKaRa公司提供的熒光定量PCR試劑盒說明書建立20 μl反應體系，反應條件：預變性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環；溶解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。結果分析：以GAPDH為內參，計算各組相應基因的ΔΔCT值。以目的基因的量為定量結果進行統計學分析。

1.4.4免疫印跡法檢測PBMCs NLRP3、Caspase-1的蛋白表達水平 提取兩組治療前后人PBMCs總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白于10%PAGE分離后，轉移置硝基纖維素膜，給予5%脫脂牛奶封閉2 h，分別孵育抗NLRP3抗體(1∶400)、Caspase-1抗體(1∶300)及抗GAPDH抗體(1∶400)，4℃避光孵育過夜。次日取出膜，給予避光室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，采用凝膠成像系統測定蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，并計算目的條帶與GAPDH灰度比值。

1.4.5外周血細胞因子(IL-1β、IL-18)的檢測 取各組清晨空腹靜脈血4 ml，離心后收集上清，采用ELISA法測定不同組間外周血IL-1β、IL-18、內毒素水平，具體操作依據試劑盒說明書進行。

1.4.6臨床療效的觀察 觀察兩組患者治療后臨床療效，其臨床療效分為痊愈、顯效、有效及無效，具體見中華醫學會頒布的SAP診治指南〔9〕。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組治療前后相關病情嚴重程度評分比較 與治療前比較，兩組治療后MCTSI評分、Ranson評分及APACHEⅡ評分均顯著降低(P<0.05)；而與對照組治療后比較，觀察組治療后上述評分降低程度更顯著(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后相關病情嚴重程度評分比較分)

與治療前比較：1)P<0.05；與對照組治療后比較：2)P<0.05；下表同

2.2兩組治療前后外周血單核細胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達水平比較 兩組治療后外周血單核細胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達水平均顯著低于治療前(P<0.05)；與對照組治療后比較，觀察組治療后上述指標明顯降低(P<0.05)，見圖1，表2。

1～4：對照組治療前、觀察組治療前、對照組治療后、觀察組治療后圖1 Western印跡檢測各組NLRP3、Caspase-1蛋白表達

表2 兩組治療前后外周血NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表達水平比較

與治療前比較:1)P<0.05；與對照組治療后比較:2)P<0.05

2.3兩組患者治療前后炎性因子水平比較 與治療前比較，兩組治療后外周血IL-1β、IL-18及內毒素水平均明顯降低(P<0.05)；而觀察組治療后上述指標降低程度較對照組治療后更明顯(P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療前后炎性因子水平比較

2.4兩組臨床療效比較 觀察組臨床總有效率顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組臨床療效比較〔n(%),n=50〕

與對照組比較:1)P<0.05

3 討 論

SAP常并發多器官功能障礙，易出現肺、腎等功能受損，表現為急性呼吸窘迫綜合征和急性腎衰竭，造成病情進展迅速，死亡率極高。大量研究顯示，炎癥反應的激活在SAP的發生及其他部位器官進行性損傷過程中起重要作用，SAP可引起大量促炎因子的激活，導致炎癥反應瀑布效應及級聯放大，造成組織器官損傷〔10〕。SAP患者早期即可出現IL-6及TNF-α水平升高，而給予抗感染治療后，其炎性水平可明顯降低，并且與病情嚴重程度及預后的改善密切相關〔11〕。因此，在早期常規治療的基礎上，給予阻斷炎癥級聯反應，調節機體免疫平衡，對于SAP的治療至關重要。

調節免疫，改善機體炎癥狀態，對于改善SAP患者病情，提高治療效果有重要意義。相關研究已證實，由免疫炎性體NLRP3介導的炎癥反應在多種疾病如器官缺血再灌注損傷、膿毒癥、惡性腫瘤等的發生、發展過程中，發揮重要作用〔4，12，13〕。NLRP3是由胞質內多種蛋白質組成的復合體，其含有凋亡相關微粒蛋白、Caspase-1等，是天然免疫系統的重要組成部分。當NLRP3受外在刺激被激活時，活化的Caspase-1隨后激活IL-1β和IL-18，產生炎癥級聯反應。相關研究顯示，NLRP3可促進炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病及動脈粥樣硬化等的進展，同時其可作為潛在的治療靶點，如動物實驗表明，抑制NLRP3激活可顯著降低糖尿病腎病的炎癥反應，改善腎功能及預后〔5，7，14〕。血必凈注射液是由多種中藥提取而成，具有調節機體免疫，抑制炎癥反應，減輕重要組織器官損傷的作用，已在SAP患者的治療中，得到了廣泛運用〔15〕。血必凈注射液對SAP治療作用的具體機制，同時對老年SAP患者NLRP3炎性小體的表達如何，目前尚不清楚。本研究中，對于老年SAP患者，在常規治療的基礎上，給予血必凈注射液，其可顯著改善患者臨床治療效果，主要表現為患者病情嚴重程度評分，包括MCTSI評分、Ranson評分及APACHEⅡ評分均較對照組顯著降低。動物實驗表明，急性胰腺損傷時，體內炎性通路可顯著激活，其NLRP3炎性小體及下游Caspase-1 mRNA、IL-1β及IL-18水平均顯著升高〔16〕。以往研究顯示，炎癥可促進細胞凋亡，而細胞凋亡是引起組織器官功能障礙的主要機制之一，在細胞凋亡通路中，Caspase-1是重要的剪切酶，抑制Caspase-1活性可顯著減輕細胞凋亡〔17〕。本研究結果顯示，血必凈注射液可顯著降低NLRP3炎性小體及下游相關炎性通路的激活，其可能與改善患者臨床癥狀及提高治療效果密切相關。NLRP3炎性小體是炎癥反應發起及進一步放大的重要環節，有研究顯示，抑制NLRP3炎性小體活性及表達，可顯著降低體內炎性細胞因子水平，從而降低炎癥反應〔18〕。針對老年SAP患者，血必凈注射液可能通過降低NLRP3炎性小體水平，抑制炎性通路激活，提高臨床療效。