氟西汀對癲癇合并抑郁大鼠海馬GFAP、NeuN表達的影響

朱勇 王琴 盧軍 黃惠勇 李豐 楊萍

(1湖南省腦科醫院神經外科，湖南 長沙 410007；2湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室)

目前癲癇-抑郁共病是一種常見的神經精神病學現象，發生率高達23.1%〔1〕。癲癇患者出現過早死亡患者中75.2%合并有抑郁等精神障礙，且自殺風險明顯升高〔2〕。因此，探索癲癇合并抑郁癥的發病機制，做好防治具有重要意義。氟西汀屬于5-羥色胺再攝取抑制劑類抗抑郁藥〔3〕，被廣泛用于焦慮癥、抑郁障礙、強迫癥等精神障礙〔4〕；目前已開始被用于癲癇合并抑郁治療中〔5〕。但有關起效機制探討甚少，故本研究采用癲癇合并抑郁模型來研究氟西汀對其行為的影響，探索氟西汀對癲癇合并抑郁大鼠模型海馬區膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元核抗原(NeuN)表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級健康SD雄性大鼠60只，周齡8～10 w，體重180～220 g，由湖南中醫藥大學動物中心提供，飼養于潔凈級環境中，飼養室溫度22～25℃，相對濕度50%～70%，換氣8～12次/h，光線每隔12 h交替，實驗前適應性飼養7 d，自由飲食。隨機分為對照組、模型組、氟西汀低、中、高劑量組各12只。

1.2主要試劑及儀器 匹羅卡品(ABCR公司，ab141301)，氯化鋰(Sigma公司，1001011078)，鹽酸氟西汀(蘇州禮來制藥有限公司，201608072)。兔抗鼠GFAP(武漢博士德生物有限公司，PB9082)，兔抗鼠NeuN(武漢博士德生物有限公司，BM4354)，二抗(北京中杉金橋生物有限公司，pv-9000)。BX43型雙目生物攝像顯微鏡(日本OLYMPUS)，熒光定量PCR儀(美國BioRad公司)。

1.3造模 ①參照文獻〔6〕進行癲癇造模。氯化鋰3 mEq/kg腹腔注射，17.5 h予以阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后注射匹羅卡品35 mg/kg。10 mg/(kg·次)追加匹羅卡品(注射匹羅卡品后30 min內無驚厥發作)，追加4次未出現癲癇持續狀態大鼠考慮造模失敗，剔除出組。28 d后慢性自發性癲癇形成，癲癇造模成功。②在成功建立癲癇模型后，根據文獻誘導慢性不可預見性應激抑郁模型(CMS)〔7〕。CMS方案包括七種不同的應激源，連續14 d應激刺激隨機排列如下(每種應激給予3～4次，連續2 d不能出現相同應激)：傾斜鼠籠17 h；禁食、禁水20 h；濕籠21 h；禁水17 h；持續光照17 h；電擊(30 V電壓)足底5 s；夾尾1 min；行為限制2 h；4℃冰水游泳(水深以大鼠的后足尖剛能觸及桶底為準)5 min。造模結束后進行行為學測定。

1.4給藥方法 氟西汀低、中、高劑量組于造模結束后給予氟西汀干預藥(5、7.5、10 mg/kg，1次/d)腹腔注射，對照、模型組同時給予同等量生理鹽水，1次/d。藥物干預28 d，治療結束后進行行為學測定。

1.5觀察指標

1.5.1行為學檢測 ①強迫游泳實驗〔8〕：將大鼠放入高為 50 cm、直徑為 20 cm 的圓柱形水缸中，水深 40 cm左右，隨機選擇大鼠，每次觀察2只，采用雙盲法檢測。實驗開始后60 s為適應時間，適應結束后記錄 5 min內大鼠不動時間。 ②曠場實驗〔9〕：將大鼠置于大小為90 cm×90 cm×45 cm(底面等分為25個等邊方格)木制箱子的中心方格內，其4只爪子均進入一方格則記錄水平運動1次，兩前爪騰空或攀附墻壁則記錄垂直運動1次，觀察大鼠在3 min 內水平運動次數及垂直運動次數。

1.5.2免疫組化 最后一次行為學測定后，每組取6只大鼠，將其麻醉處死，取出大鼠腦組織，進行冠狀位切片，厚度約5 μm。經脫蠟、水化后，依次進行抗原修復、內源性過氧化物酶消除、非特異性蛋白封閉、4℃孵育GFAP、NeuN一抗(1∶100)過夜、室溫孵育二抗2 h、酶聯反應、二氨基聯苯胺(DAB)染色、蘇木素復染、脫水透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織染色情況，細胞呈現棕黃色染色者為陽性。染色強度使用IPP6.0軟件分析海馬齒狀回平均光密度。

1.5.3RT-RCR 最后一次行為學測定后，每組取6只大鼠，將其麻醉處死，在冰上提取出大鼠海馬。用Triziol法提取總RNA，用反轉錄酶將mRNA反轉錄為cDNA。構建聚合酶體系，Taq酶催化，熱循環：95℃預熱5 min，40個循環(94℃ 20 s，退火20 s，72℃ 30 s)。將不同濃度標準品的對數值與閾值循環數(Ct)值得出校正曲線；通過2-△△Ct法計算目的基因與內參物(β-actin)Ct值的差值，即目的基因的相對表達水平。GFAP上游引物：5′GACCGCTTTGCTAGCTA 3′，下游引物：5′GGTTTCATCTTGGAGCT 3′；NeuN上游引物：5′CACGGCATGACCCTCTACAC 3′，下游引物：5′ GTCTGTGCTGCTTCATCTGC3′；β-actin上游引物：5′GTCGTACCACTGGCATTGTG 3′，下游引物：5′TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG 3′。

1.6統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠行為學變化 造模后，與對照組相比，模型組、氟西汀低、中、高劑量組不動時間明顯延長，垂直運動次數、水平運動次數明顯下降(P<0.05)；干預后，模型組不動時間明顯長于對照組，垂直運動次數、水平運動次數明顯低于對照組(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀低、中、高劑量組不動時間明顯縮短，垂直運動次數、水平運動次數明顯增加(P<0.05)；氟西汀高劑量組不動時間縮短，垂直運動次數、水平運動次數增加較氟西汀低、中劑量組更明顯(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN表達 GFAP 染色顯示大鼠海馬齒狀回細胞胞質及突起呈棕黃色。對照組胞質染色較淡；模型組胞質染色呈棕黃色，呈桿狀或錐狀，突起粗短，且數量增多；氟西汀低、中、高劑量組染色較模型組淺，且數量減少。見圖1。NeuN染色顯示大鼠海馬齒狀回細胞質及胞核可以觀察到棕黃色或者黃色顆粒。對照組胞質及胞核可見大量棕黃色或者黃色顆粒；模型組胞質及胞核僅可見少量表達；氟西汀低、中、高劑量組陽性表達較模型組有所增加，尤其氟西汀高劑量組表達更為明顯。見圖2。與對照組相比，模型組GFAP表達明顯增加、NeuN表達明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，氟西汀低、中、高劑量組GFAP表達明顯下降、NeuN表達明顯增加(P<0.05)；氟西汀高劑量組GFAP表達下降、NeuN表達增加較氟西汀低、中劑量組更明顯(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠造模后及干預后行為學比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與氟西汀高劑量組比較:3)P<0.05，下表同

圖1 各組海馬齒狀回GFAP染色(DAB，×200)

圖2 各組海馬齒狀回NeuN染色(DAB，×200)

表2 各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN表達

2.3各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN mRNA表達水平的比較 模型組GFAP mRNA表達明顯高于對照組，NeuN mRNA表達明顯低于對照組(P<0.05)；氟西汀低、中、高組GFAP mRNA表達均明顯低于模型組，NeuN mRNA表達明顯高于模型組(P<0.05)，尤其是氟西汀高劑量組，與氟西汀低、中劑量組相比有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN mRNA表達

3 討 論

癲癇合并抑郁的發生率比普通人群高5～7倍，尤其在長期發作不能控制難治性癲癇患者中抑郁的發生率更高〔10〕。近年來隨著神經調控技術發展，癲癇的治療療效顯著提高，但并發精神障礙仍然是導致癲癇患者生活質量下降的主要原因之一，其中癲癇后抑郁明顯增加癲癇患者自殺的風險〔11〕。故對癲癇合并抑郁患者的抗抑郁治療尤為重要。研究證實對5-羥色胺再攝取抑制劑對癲癇患者較為安全，能明顯降低合并抑郁患者抑郁量表評分〔12〕。故本研究采用鋰-匹羅卡品癲癇造模+慢性不可預知性應激建立癲癇合并抑郁造模，該模型已廣泛用于探索癲癇合并抑郁發病及治療的動物模型〔13〕。并選用5-羥色胺再攝取抑制劑經典藥物氟西汀對癲癇合并抑郁大鼠進行干預。本研究成功地誘發了癲癇大鼠抑郁樣行為，而氟西汀能明顯改善癲癇合并抑郁大鼠抑郁行為，呈劑量依賴性。

研究證明鋰-匹羅卡品大鼠慢性期病理表現為海馬神經元大量脫失，神經膠質細胞活化增生；神經元脫失和膠質增生為癲癇復發重要原因〔14〕。星形膠質細胞為神經元運輸營養物質和排除代謝產物，具有支持和引導神經元遷移的作用，同時還參與神經元的突觸傳遞活動〔15〕。GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，星形膠質細胞反復、長時間的異常高功能狀態與癲癇的發展密切相關〔16〕。NeuN是一種可溶性核蛋白，在體外能與DNA 結合，識別神經元特異的核蛋白單克隆抗體的產生，已成為中樞神經系統成熟神經元的常用標志物〔17〕。在大鼠大部分神經元(大腦皮質、基底核等)有明顯表達〔18〕。本研究與既往研究一致〔19〕。氟西汀治療后GFAP表達下降，NeuN表達增加，且呈劑量依賴性，說明氟西汀能通過抑制GFAP表達、增加NeuN表達改善抑郁行為，發揮神經保護作用。