單核細胞趨化蛋白-1在球囊損傷術后大鼠頸動脈內膜的表達及對人參皂苷Rg3的作用

蹇明輝 陳文明 石蓓

(遵義醫科大學附屬醫院心血管內科，貴州 遵義 563099)

經皮冠狀動脈腔內血管成形術(PTCA)是當前治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的主要手段，但術后3～6個月支架內再狹窄的發生率高達30%～50%，即使應用藥物洗脫支架，再狹窄的發生率仍有5%～10%，由此可見，支架內再狹窄的發生仍是PTCA后的主要的并發癥〔1〕。因此，預防PTCA后再狹窄的發生顯得尤為重要。人參皂苷Rg3是從人參中提取的一種四環三萜皂苷類化合物，具有誘導腫瘤細胞凋亡〔2，3〕、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移〔4〕、與化療聯合協同增效〔5〕、提高機體免疫力〔6〕等方面的藥理學活性。本課題組前期研究結果發現，球囊損傷大鼠頸動脈內膜后，人參皂苷Rg3能通過促進血管平滑肌細胞的凋亡〔7〕，并抑制相關炎癥因子表達〔8〕，減輕損傷后血管內膜的增生作用。本研究進一步觀察血管內膜損傷后單核細胞趨化蛋白(MCP)-1的表達及變化規律，并探討人參皂苷Rg3對 MCP-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠50只，體重(300±20)g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，動物使用合格證號SCXK(渝)2017-0005。在普通級清潔環境下正常飼養，溫度20～24℃，自由飲水、進食。

1.2藥品與試劑 純度98%的人參皂苷Rg3購自上海篤瑪生物科技有限公司；蛋白抗體MCP-1和β-actin購自北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化試劑盒購自中山生物公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒和RNA逆轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3儀器 2.0×12.0 mm球囊導管購自美國 Baxter Healthcare 公司；正置熒光電子顯微鏡購自日本Olympas公司；熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.4實驗分組 50只SPF級健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組，模型組(3、7、14 d)、人參皂苷Rg3分10 mg/(kg·d)組共5組，每組10只。假手術組只行左頸總動脈血管分離術，其余各組均進行球囊損傷術。人參皂苷Rg3組于術后待大鼠清醒后開始灌胃給藥，連續14 d。

1.5制備模型 根據本課題組已成熟的球囊損傷頸動脈術建立動物模型〔7，8〕，分別取各組左頸總動脈進行病理形態學觀察，用免疫組織化學染色和熒光定量法PCR觀察MCP-1的表達。

1.6蘇木精-伊紅(HE)染色 球囊損傷頸動脈術后3，7，14 d，各組用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后分離頸動脈，取損傷中段部位血管0.5 cm，用生理鹽水洗去血跡，4%多聚甲醛固定24 h，經脫水處理后石蠟包埋，行HE 染色，在正置光學顯微鏡下觀察結果并拍照。結果用IPP圖像分析軟件測量損傷血管的內膜厚度、中膜厚度和血管管腔面積，并計算內膜/中膜的面積比率。

1.7免疫組織化學染色檢測MCP-1的蛋白表達 取石蠟塊均勻切片，進行免疫組織化學染色，具體實驗操作按照免疫組織化學試劑盒說明書進行。在顯微鏡下觀察頸動脈血管組織中出現棕黃色顆粒，即為 MCP-1 蛋白陽性表達信號，分別拍攝各組圖片，采用IPP圖像分析軟件進行結果分析。

1.8RT-PCR 檢測MCP-1的mRNA表達 術后3、7、14 d，各組經麻醉后分離頸動脈，取損傷血管，用Tripure試劑提取總RNA，用核酸蛋白測定儀鑒定RNA純度和量。將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應條件：①逆轉錄反應37℃、15 min；②逆轉錄酶的失活反應85℃、5 s，樣本4℃保存。進行PCR反應擴增，其步驟：①預變性(1個循環)：95℃變性5 min；②PCR反應：95℃ 30 s，65℃ 30 s退火、延伸，45個循環；③融解曲線：95℃ 10 s，55℃ 1 min。待擴增反應結束后，CT值采用2-△△Ct法進行分析，比較各組目的基因表達變化。引物序列及擴增長度見表1。

表1 RT-PCR 引物序列和擴增產物長度〔9〕

1.9統計學分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠頸動脈球囊損傷后血管內膜形態學指標變化情況 假手術組頸動脈血管內膜光滑，沒有明顯增厚現象；損傷3 d，頸動脈血管內膜開始增厚，7～14 d，頸動脈血管內膜不斷增厚，內膜/中膜厚度比值逐漸增加，血管管腔不斷縮小；與模型組(損傷14 d)相比，人參皂苷Rg3組頸動脈血管內膜增生明顯減輕，內膜/中膜厚度比值降低，血管管腔明顯增大(圖1、表2)。

2.2各組增生內膜MCP-1蛋白表達水平 假手術組頸動脈血管有少量 MCP-1表達；損傷3 d，頸動脈血管內膜側局部可觀察到 MCP-1 蛋白表達開始增強(棕褐色陽性顆粒明顯增多)，7～14 d，隨著損傷時間延長，內膜逐漸增厚，增生內膜中 MCP-1 陽性顆粒的數量逐漸增多，顏色不斷變深，平均光密度值逐漸增大，14 d 達峰值；與模型組損傷14 d相比，人參皂苷Rg3組新生內膜中棕色顆粒明顯減少，顏色變淺，平均光密度值明顯減小(圖2，表2)。

圖1 球囊損傷后各組頸動脈血管內膜形態學的變化(HE染色，×200)

表2 球囊損傷后各組頸動脈血管內膜、中膜的變化及MCP-1蛋白、mRNA水平比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組損傷14 d比較：3)P<0.01

圖2 球囊損傷后各組增生內膜 MCP-1蛋白表達(免疫組織化學，×400)

2.3各組增生內膜 MCP-1 mRNA表達水平 假手術組頸動脈血管MCP-1 mRNA表達水平較低；模型組損傷 3 d，頸動脈血管MCP-1 mRNA表達水平開始增加，7～14 d，隨著損傷時間延長，內膜逐漸增厚，頸動脈血管 MCP-1 mRNA表達水平逐漸增加，14 d達峰值；與模型組損傷14 d相比，人參皂苷Rg3組頸動脈血管 MCP-1 mRNA表達水平明顯下降，見表2。

3 討 論

PTCA后損傷血管內膜過度增生，導致血管再狹窄的發生，其中血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移是造成內膜增厚、新內膜形成和血管再狹窄的重要環節。本實驗通過建立球囊損傷大鼠頸動脈模型，以此模擬血管發生再狹窄的反應過程，結果與韓雅玲等〔10〕報道一致。

炎性因子介導的各種炎性反應在PTCA后血管再狹窄的形成中發揮著重要的作用。MCP-1是一個重要的促炎細胞因子，屬于CC趨化因子家族的一個小細胞因子，具有誘導單核/巨噬細胞趨化和激活單核/巨噬細胞的雙重作用。在血管平滑肌細胞的表面存在MCP-1受體有利于MCP-1誘導損傷血管平滑肌細胞的增殖和遷移，參與PTCA后新內膜的增生過程。研究證實，在大鼠頸動脈球囊損傷后MCP-1基因表達明顯高于正常血管〔11〕；在冠心病患者PTCA后血漿中呈高水平表達的MCP-1能通過影響血管重塑而參與冠脈支架術后再狹窄的發生過程〔12，13〕。本研究提示，MCP-1參與血管再狹窄發生的病理過程。

近年來，對中醫藥防治 PTCA后再狹窄的研究已經有所突破。單味中藥及其提取物如川芎嗪、葛根素、水蛭素、雷公藤紅素、花刺參黏多糖、三七總皂苷等及中藥復方如血府逐瘀湯、抵當湯、補陽還五湯、四逆湯、冠心通絡方、通冠膠囊、芎芍膠囊等都顯示具有抗血管再狹窄作用〔14，15〕。本研究提示，人參皂苷Rg3抑制了球囊損傷后頸動脈血管MCP-1的表達。

總之，內皮損傷后MCP-1的表達參與血管再狹窄過程，人參皂苷Rg3能抑制血管內膜損傷后引起的內膜增生，可能與抑制MCP-1表達有關，但具體的作用機制有待進一步研究。