天然紫草素衍生物SYUNZ-7對腫瘤的作用效果及機制

鄧必勇 鄧必祥

(貴州省骨科醫院骨外科，貴州 貴陽 550002)

祖國傳統醫學治療惡性腫瘤具有獨特的優勢，其中紫草為紫草科草本植物，有悠久的藥用歷史，主治血熱毒盛、麻疹不透、濕疹、燙傷等。近年隨著對紫草研究的深入，已明確紫草主要成分是紫草素、紫草寧和其衍生物萘醌類化合物〔1〕。現代藥理學證明紫草素有多種生物活性，如抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗甲狀腺亢進、降血糖、抗免疫低下等，對多種腫瘤細胞有確切的促凋亡和抑制生長的效果〔2〕。有研究證明紫草分離物有抗人癌細胞ECA-109、MGC-803的作用，紫草萘醌類衍生物可濃度依賴性的抑制多種前列腺癌細胞增殖〔3〕。但天然的紫草類化合物存在毒性大或抗瘤作用達不到理想結果等不足，仍沒有在臨床上應用。為了增強其抗腫瘤作用及降低毒副作用，黃志紓等〔4〕合成紫草素萘醌類衍生物，并證實半合成的紫草類衍生物抗腫瘤作用高于天然紫草類化合物。SYUNZ-7是由紫草素天然分離物β-二甲基丙烯阿卡寧基礎上進行改造得到〔5〕，本研究擬探討天然紫草素衍生物SYUNZ-7對腫瘤的作用效果及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及瘤株 昆明種小鼠(清潔級，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK軍2002-001)，體重20～24 g，雌雄各半。BALB/c裸小鼠，4～5周齡，雌雄各半(SPF級，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號N0003915)。小鼠移植性腫瘤艾氏腹水癌(EAC)、人骨肉瘤細胞株MG-63、人肺癌細胞株GLC-82、人口底癌細胞株KB、人肝癌細胞株HepG2、人胃癌細胞株MGC-803均來源于貴州醫學院第一附屬醫院研究所。

1.2試劑、儀器和樣品 SYUNZ-7由貴州大學化學化工學院改造，在臨床應用前需先進行溶解，可用二甲基亞砜(DMSO)處理，再通過雙蒸水稀釋。噻唑藍(MTT)由上海益啟生物科技有限公司生產，羥基喜樹堿為黃石李時珍藥業集團武漢李時珍藥業有限公司。第Ⅷ因子相關抗原抗體為上海臻科生物科技有限公司生產。BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀為美國BD Biosciences生產，model 550 Microplate reader為(美國)賽默飛/Thermo Fisher產品。

1.3MTT法〔6〕檢測SYUNZ-7的抗瘤作用 在96孔板上接種以上5種對數生長期的腫瘤細胞，每孔0.195 ml，培養4 h，再分別在每孔中將0.39～25.00 μg/ml 5 μl的SYUNZ-7加入，繼續培養3 d。實驗結束前4 h在每孔中加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，測定前棄去培養液，每孔加入0.1 ml的DMSO。每孔的吸光度(A)值通過Thermo Fisher550酶聯免疫檢測儀在570 nm波長下進行檢測。根據抑制率=(1-用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%公式求出增殖抑制率，半數抑制濃度(IC50值)通過醫學統計集法計算程序可求。

1.4抗小鼠移植性腫瘤 根據《抗腫瘤藥物藥效學指導原則》〔7〕進行試驗，在無菌條件下抽取小鼠腫瘤EAC細胞，再用氯化鈉溶液進行稀釋，稀釋成2.5×107個/ml。在每只昆明種小白鼠右腋皮下接種0.2 ml，并隨機分為1、2、4、8 mg/kg不同劑量的SYUNZ-7組、 羥基喜樹堿陽性藥物(HCPT)對照組(4 mg/kg)、15%DMSO溶液對照組、生理鹽水對照組各10只，雌雄各半。在瘤株接種24 h后進行腹腔注射給藥，1次/2 d，共5次。給藥完成后的第2日處死小鼠，稱體重，分離瘤塊稱重，抑瘤率=(1-用藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%，重復測量2次，取平均值。

1.5抗人癌裸鼠移植瘤實驗 把體外培養對數生長期的MG-63細胞制成單細胞懸液，細胞密度為1×107個/ml，在每只BALB/c裸小鼠右腋皮下接種0.2 ml，待腫瘤生長可以度量時，游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)、短徑(b)。體積=(π/6)×〔(a+b)/2〕3。后根據腫瘤的大小隨機將BALB/c裸小鼠分為1、2、4 mg/kg不同劑量的SYUNZ-7組、 HCPT對照組(5 mg/kg)、15%DMSO溶液對照組、生理鹽水對照組各10只，雌雄各半。再進行腹腔注射給藥，1次/3 d，共7次。實驗完成時處死小鼠，稱體重，并將瘤塊剝出來稱重，抑瘤率同1.4，重復測量2次，取平均值。

1.6流式細胞儀檢測 收集不同時間(24、48、72、96 h)處理的MG-63細胞和不同濃度(1.56、3.12、6.25 μg/kg)處理的SYUNZ-7，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次后以70%濃度的乙醇固定并過夜，采用10 μmol/L碘化丙啶進行細胞染色，染色5 min，低溫避光0.5 h，采用流式細胞儀檢測DNA含量，BectonDickinson公司LYSIS軟件進行分析。

1.7免疫組化法 在上述裸小鼠實驗完成時，用10%甲醛溶液固定1、2、4 mg/kg不同濃度的SYUNZ-7組、HCPT對照組、15%DMSO溶液對照組、裸小鼠NS對照組的腫瘤組織標本，石蠟包埋，3 μm切片。在到0.01 mol/l pH為6.0的枸櫞酸緩沖液中置入脫蠟、水化、封閉處理好的切片。滴加第一抗體兔抗人Ⅷ因子相關抗原抗體20 μl，稀釋成1∶200濃度，4℃孵育過夜，PBS洗滌。滴加生物素標記的第二抗體，37℃孵育0.5 h，PBS洗滌，滴加過氧化物酶標記鏈霉素抗生物素蛋白，37℃孵育0.5 h，洗滌，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，后常規沖洗，復染，封片，顯微鏡觀察。根據Weidner等〔8〕報道的檢測方法測定腫瘤微血管密度(MVD)。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1SYUNZ-7體內抗腫瘤及體外抗增殖活性作用

2.1.1SYUNZ-7對多種腫瘤細胞的增殖抑制作用 經MTT法測得結果顯示，SYUNZ-7對MG-63、GLC-82、HepG2、KB、MGC-803細胞的IC50值分別為(4.15±0.07)μg/ml、(2.17±0.03)μg/ml、(9.98±0.22)μg/ml、(5.42±0.01)μg/ml、(6.42±0.15)μg/ml，提示SYUNZ-7可抑制多種腫瘤細胞增殖，并呈現濃度依賴性，見表1。

表1 SYUNZ-7對多種腫瘤細胞的增殖抑制率

-代表無抑制率；表2同

2.1.2SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63細胞裸小鼠移植瘤生長的抑制作用 1、2、4、8 mg/kg SYUNZ-7對小鼠EAC(實體型)的抑瘤率分別為(40.4±0.2)%、(50.8±2.2)%、(61.2±1.9)%、(65.5±7.2)%。隨著SYUNZ-7劑量的增加對MG-63細胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率增高，見表2。

表2 SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63細胞裸小鼠移植瘤生長的抑制作用

與NS組比較:1)P<0.05;與15%DMSO組比較:2)P<0.05；3)死亡2只

2.2SYUNZ-7誘導人骨肉瘤MG-63細胞凋亡 經流式細胞儀分析得，MG-63細胞經6.25 μg/ml SYUNZ-7處理24、48、72、96 h和2%DMSO處理72 h的凋亡率分別為27.9%、58.2%、65.0%、71.5%、1.2%。MG-63細胞經1.56、 3.12、6.25、12.50 μg/ml SYUNZ-7處理72 h的凋亡率分別為11.8%、68.1%、70.4%、51.4%。提示SYUNZ-7可濃度依賴性及時間依賴性誘導MG-63細胞凋亡，但是經12.5 μg/ml SYUNZ-7處理的MG-63細胞72 h凋亡率低于6.25 μg/ml SYUNZ-7處理的，可能和長時間及濃度高藥物處理引起MG-63細胞溶解及壞死相關。

2.3SYUNZ-7對MG-63細胞周期的作用 隨著 SYUNZ-7處理濃度的增加或作用時間的延長，MG-63細胞G2/M期細胞比例降低，S期細胞比例上升，提示 SYUNZ-7對MG-63細胞S期至G2/M期轉化有阻滯作用，見表3、4。

表3 6.25 μg/ml SYUNZ-7作用MG-63細胞的周期分布(%，n=5)

表4 不同劑量SYUNZ-7作用MG-63細胞的周期分布(%，n=5)

2.4SYUNZ-7對MG-63細胞裸小鼠移植瘤血管生成的作用 1、2、4 mg/kg SYUNZ-7組的MVD值分別為(20.1±2.8)條/每視野、(15.8±2.6)條/每視野、(13.5±1.7)條/每視野。15%DMSO溶液對照組、羥基喜樹堿陽性對照組、生理鹽水對照組MVD分別為(27.0±2.3)條/每視野、(16.4±2.0)條/每視野、(25.2±2.8)條/每視野。SYUNZ-7各濃度組腫瘤組織中的MVD值均低于15%DMSO溶液對照組、生理鹽水對照組(P<0.05)，提示SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63細胞裸小鼠移植瘤血管的生成。

3 討 論

本研究提示SYUNZ-7有較強的細胞毒作用，臨床上對于GLC-82、HepG2、MG-63、KB人癌細胞的研究鮮有報道〔9〕。天然紫草萘醌衍生物天然紫草萘醌衍生物93/637(SA)及萘醌化合物LⅢ對體外培養的DU145、PC-3、ECA109等人癌細胞有強細胞毒作用〔10〕。表明無論是紫草萘醌衍生物或化合物均對多種人癌細胞有抗癌活性。而關于體內抗瘤作用研究，國內外臨床上相關研究較少，較為典型的是趙守先〔11〕報道顯示紫草提取物紫草素A可抗小鼠移植腫瘤S-180、EAC。本研究結果提示，在不同劑量下SYUNZ-7對小鼠EAC(實體型)的抑瘤率均高于30%，且呈劑量依賴性抑制。2、4 mg/kg SYUNZ-7對MG-63細胞裸小鼠均有明顯的抑瘤率。

細胞凋亡在腫瘤的發生、進展及退化過程中有重要作用，在大多數腫瘤組織中均存在細胞凋亡〔12〕。研究報道，新疆紫草素對大腸癌細胞凋亡有誘導作用〔13〕。本研究結果也證實SYUNZ-7對MG-63細胞凋亡有誘導作用，使細胞周期停滯在S期，但具體通過什么途徑調節腫瘤細胞周期和誘導腫瘤細胞凋亡，臨床尚未闡明，本實驗也未深入探討。但紫草素對惡性黑色素瘤A375-S2細胞周期研究中發現存在細胞周期調控因子細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)4活性降低及P53活性異常增高〔14〕。而Caspase-3激活是紫草衍生物紫草衍生物β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對HL-60細胞凋亡的誘導作用機制之一〔15〕。提示紫草素萘醌衍生物或化合物調控細胞周期因子活性與調節細胞周期及誘導細胞凋亡作用密切相關〔16〕。而關于SYUNZ-7對MG-63細胞凋亡的誘導作用有待深入探討。新生血管和腫瘤細胞的生長、增殖也有重要作用，腫瘤的復發、轉移及分化和新生血管的密度密切相關〔17〕。MVD是臨床上反映腫瘤血管生成的常用客觀指標，既往研究報道，紫草素對B16黑色素瘤的血管生成及內皮細胞的增殖和轉移有抑制作用〔18〕。本研究表明SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63細胞裸小鼠移植瘤血管的生成。綜上，天然紫草素衍生物SYUNZ-7體內外抗瘤作用較強，其抗瘤作用機制可能和抑制腫瘤血管生成、阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡相關，從而可抑制腫瘤細胞DNA合成及腫瘤細胞增殖。本研究僅為一個初步試驗，日后可增加毒性試驗及瘤譜試驗進行多作用靶點的研究。