五味子提取物治療對卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和骨強度的影響

郭軍鵬 張兆鵬 于蘭英 劉芳 劉宏巖

(長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117)

隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥已成為常見病、多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列入三大老年病之一。傳統(tǒng)中醫(yī)學理論認為腎虛是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本病因病機，因此治療以補腎健骨為基本原則〔1，2〕。五味子為收澀類中藥的典型代表，列于《神農(nóng)本草經(jīng)》上品中藥，具有滋補強壯之功效。傳統(tǒng)應用五味子的主要方法是水煎，其成分以多糖類居多；而五味子醇部位提取物很少得到應用〔3～5〕。本文應用去卵巢方法復制絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松病理模型，分別應用五味子水提物和醇提物予以治療，以血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-7、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和骨強度為指標，探討五味子不同提取物防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的療效。

1 材料與方法

1.1動物分組及給藥 雌性SD大鼠50只，體重(200±20)g，購自吉林大學基礎醫(yī)學實驗動物中心。適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為對照組、模型組、阿侖膦酸鈉組、五味子水提物組和醇提物組，每組10只。病理模型制備方法：大鼠經(jīng)腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，取俯臥位固定于手術臺上，剃毛器在背部兩側剃毛備皮，碘伏消毒，由脊柱旁1～2 cm、肋下1 cm處打開腹腔，找到埋于白色脂肪中的卵巢(黃紅色)，拉出、結扎，行卵巢切除術，還回腹腔并縫合肌肉和皮膚，同法摘除另一側卵巢〔6〕。對照組大鼠做假手術，即打開腹腔在卵巢旁取等大體積的脂肪組織切除。術后給予生理鹽水配制的青霉素溶液(1萬U/ml)，連續(xù)飲用3 d，預防感染。用成人常規(guī)用藥量按人鼠體重系數(shù)換算大鼠等效劑量，阿侖膦酸鈉1.428 mg/(kg·d)；五味子水提物組和醇提物組分別給予水提物和醇提物1.5 g生藥/(kg·d)(相當于人用9 g/d)，對照組和模型組灌胃給予生理鹽水1 ml/d，連續(xù)給藥3個月。

1.2主要試劑及儀器 阿倫膦酸鈉：購自MSDPHARMA(SINGAPORE)PTE LTD.Savio IndustrialS.R.L(Italy)(批號：M033342)。五味子提取物制備方法：8倍體積水，室溫浸泡12 h，過濾再次浸泡12 h，合并濾液，濃縮得五味子水提物(0.375 g生藥/ml)；五味子水提物殘渣70%酒精浸泡12 h，過濾再次浸泡12 h，合并濾液，濃縮得五味子醇提物(0.375 g生藥/ml)。BMP-7、TRACP試劑盒：購自北京華英生物技術研究所。骨骼強度測定儀(YLS-16A型)：濟南益延科技發(fā)展有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1BMP-7、TRACP測定 取材前12 h禁食不禁水。各組大鼠麻醉狀態(tài)下打開腹腔，腹主動脈取血，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清，-20℃保存待測。按試劑盒說明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定BMP-7、TRACP水平。

1.3.2骨強度的測定 完整剝離右側脛骨，仔細去除周圍軟組織，保留骨膜，立即應用小動物骨骼強度測定儀以骨折為終點測定骨強度。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1五味子不同提取物對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BMP-7和TRACP的影響 與對照組比較，模型組大鼠BMP-7顯著下降(P<0.01)、TRACP顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，阿侖膦酸鈉組BMP-7顯著增加(P<0.01)，TRACP顯著下降(P<0.01)；五味子水提物組和醇提物組大鼠BMP-7均明顯增加(均P<0.01)，五味子醇提物組增加更加顯著(<0.01)；兩組大鼠TRACP均顯著下降(均P<0.01)。見表1。

表1 五味子不同提取物對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清BMP-7和TRACP的影響

與對照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01，與五味子水提物組比較：3)P<0.01；下表同

2.2五味子不同提取物對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨強度的影響 與對照組〔(6.74±0.39)kg〕比較，模型組大鼠脛骨骨強度顯著下降〔(5.47±0.41)kg，P<0.01〕。與模型組比較，阿侖膦酸鈉組大鼠脛骨骨強度顯著增強〔(7.53±0.27)kg,P<0.01〕；五味子水提物組大鼠脛骨骨強度〔(4.89±0.33)kg〕變化不顯著，五味子醇提物組大鼠脛骨骨強度顯著增強〔(7.01±0.27)kg,P<0.01〕。

3 討 論

對雌性大鼠實施卵巢切除術，雌激素生成減少，破骨細胞骨吸收作用強于成骨細胞骨形成繼而發(fā)展成為骨質(zhì)疏松。骨新陳代謝時許多血清生化指標隨之變化，主要有BMP-7、TRACP、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)、骨保護素(OPG)、 尿吡啶啉(Pyr)、尿脫氧吡啶啉(D-Pyr)、Ⅰ型膠原氨基末端肽(NTX)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(CTX)等〔7，8〕。BMPs是TGF-β超家族成員，BMP-7是骨形成最早的信號分子，主要由骨骼及腎臟產(chǎn)生，有研究認為BMP-7是中醫(yī)“腎主骨”理論的主要物質(zhì)基礎，其作用機制是骨髓間充質(zhì)細胞在BMPs作用下分化為成骨及軟骨細胞〔9～12〕。TRACP是破骨細胞在骨吸收時產(chǎn)生和分泌的一種糖蛋白。在骨吸收過程中，破骨細胞在骨表面形成富含肌動蛋白的封閉帶，錨定在礦化的骨基質(zhì)上，由此形成吸收腔隙。破骨細胞向腔隙內(nèi)分泌H+和TRACP等降解骨基質(zhì)而行使骨吸收功能〔13～15〕。本研究說明五味子水提物和醇提物都能夠增強成骨細胞活性，并抑制破骨細胞降解膠原纖維和骨質(zhì)吸收，但五味子醇提物比五味子水提物作用效果更加顯著。綜上，五味子醇提物通過抑制破骨細胞骨吸收同時增加成骨細胞活性而增強去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨強度。