骨質疏松癥發病相關長鏈非編碼RNA的研究進展

李曉宇 費琦 林吉生 于凌佳 楊雍 李東 李錦軍 孟海

首都醫科大學附屬北京友誼醫院骨科，北京 100050

原發性骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的全身性骨骼疾病，導致骨骼脆性改變和骨折風險增加。隨著我國老齡化社會的到來，原發性骨質疏松癥已成為面臨的重要健康問題。骨質疏松癥是一種復雜的疾病，受環境因素和遺傳因素影響[1]。OP的易感性由多種遺傳變異及其與飲食運動等環境因素之間的相互作用而決定。骨質疏松的遺傳率估計為50%～85%，提示遺傳因素在OP發病中的重要性[2]。鑒定OP相關基因，并明確其致病機制，對于OP的預防和治療意義重大。長鏈非編碼RNA(long non-coding，lncRNA)是近年來研究的熱點，它是一種長度大于200個核苷酸的無或很少編碼蛋白質的RNA，雖然一段時間人們認為lncRNA只是轉錄中的副產物，不具有生物學作用。但是近年來，很多的研究證實lncRNA具有復雜的生物學功能，與人類疾病的發生有密切的聯系。lncRNA可以在轉錄、轉錄后和表觀遺傳學水平上調節靶基因，參與包括骨質疏松癥在內的疾病的發生[1-2]。自從Morrison于1992年發現維生素D受體基因型與骨密度關系密切以來，目前已經發現近100種骨質疏松相關基因，主要包括以下4個方面：(1)鈣離子相關激素及受體；(2)成骨細胞；(3)破骨細胞；(4)其他方面。骨質疏松相關的基因研究是目前研究的熱點與難點，其發病的分子機制了解還十分有限，這已成為骨質疏松癥的臨床治療與基礎研究的瓶頸。基因調控位點的發現及其對骨密度變異的生物學功能的闡明，對于了解骨質疏松癥的病因，開發新的骨質疏松癥篩查、預防和治療方法具有重要意義。本文就lncRNA在骨質疏松方面的研究進展展開綜述，探討其研究現狀及發展前景。

1 LncRNA與骨質疏松

大約70%的人類基因組能夠被轉錄，而其中僅有1%～2%能夠編碼蛋白，余下98%均為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。ncRNA在很長一段時間里都被認為轉錄的副產物。直到1990年，Richard Jorgensen在對牽牛花做基因改造時發現添加的DNA序列會影響內源性基因的表達，RNA干擾(RNAi)的首次發現才引起研究者對ncRNA功能的關注。根據核苷酸序列的長度，ncRNA可分為短鏈ncRNA(short/small ncRNA)和長鏈lncRNA(long ncRNA)，一般將長度大于200核苷酸ncRNA定義為lncRNA。lncRNA雖然不編碼蛋白質，但通過反式和順式兩種方式在調控基因轉錄中發揮重要作用[3]，可以在轉錄、轉錄后和表觀遺傳學水平上調節靶基因，與包括癌癥和骨質疏松癥在內的疾病有關[4]。lncRNA在細胞核內和胞質中可以通過各種機制調節基因的表達，在細胞核內主要通過參與表觀遺傳調控、參與轉錄水平調控、對胞核核體結構進行調節[5-7]。lncRNA可以在轉錄、轉錄后和表觀遺傳學水平上調節目標基因，目前發現其與mRNA、miRNA、蛋白均存在互作機制，包括OP在內的多種疾病中都有lncRNA調控涉及，有望成為疾病診斷與預測的生物學指標[4]。人體的骨代謝是維持一種“骨生成與骨凋亡”的平衡狀態，維持這種平衡需要一系列信號通路共同參與調控，包括cAMP、CaMK、MEG3、DEPTOR、MAPK等[8-9]，lncRNA在這個過程中扮演了重要的角色。

lncRNA是骨質疏松癥病理生理過程的重要調控因子，現有的研究已經證實骨質疏松和骨密度具有遺傳性，已有超過60個易感位點被發現與骨質疏松和BMD有關[10-11]。已發現lncRNA-H19、TIST和MEG3均被發現涉及骨質疏松相關的成骨細胞分化，凋亡過程[12-14]。Fei 等[15]通過高通量RNA測序鑒定了絕經后骨質疏松癥患者和正常對照患者血液樣本的lncRNA和mRNA表達，共獲得185個顯著的差異表達mRNAs和51個顯著的差異表達lncRNA。這也是首次通過RNA測序得到絕經后骨質疏松的lncRNA表達，并構建出了差異表達的mRNA與差異表達的lncRNA共表達網絡。Jin等[16]研究了骨質疏松患者外周血淋巴細胞中的LncRNA表達，共發現了70個顯著表達的LncRNA，其中上調LncRNA39個，下調LncRNA 31個。陳娟等[17]對比了絕經后骨質疏松癥6例和健康絕經后婦女3例的lncRNA表達水平，發現了8條lncRNAs 可能通過調控 Jak/STAT、MAPK、胰島素通路和鈣離子代謝等信號通路參與絕經后骨質疏松癥的發生發展過程。Zhang等[18]采用人全轉錄組芯片對骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的差異編碼和非編碼轉錄表達譜及功能網絡分析進行了研究，在成骨分化過程中，共檢測到1 408個差異表達的LncRNA，其中785個顯著上調，623個顯著下調。Zuo等[19]發現在間充質干細胞早期成骨分化過程中，LncRNA表達不同，實驗組和對照組之間存在116個差異表達的lncRNA，提示了LncRNA可能在成骨細胞分化中發揮某些作用。目前的研究提示了lncRNA可能參與調解骨質疏松的發病過程，但是多數的研究只停留在轉錄組的初步篩選，并未涉及更加深入的研究，有待更加深入的考證。

2 LncRNA與鈣離子

鈣是人體內的重要物質元素，人體99%以上的鈣離子分布于骨組織中，因此鈣離子是研究骨質疏松不可或缺的一項重要因素。除構成骨以外，鈣離子還可以通過激活多種細胞外信號通路參與骨形成，如環單磷酸腺苷(cAMP)、鈣調蛋白激酶II(CaMK II)和多種鈣離子依賴蛋白等。lncRNA可以通過調節與鈣相關信號而參與骨代謝相關細胞的增殖、分化、運動、凋亡等各個生理病理過程。Mccoy等[20]在研究一種疫苗佐劑過程中發現，lncRNA A_30_P01018532與炎癥免疫相關，上調其表達可以顯著提高細胞內游離鈣離子水平。Hadji等[21]觀察到lncRNA H19在主動脈鈣化患者中存在高表達，通過基因組分析，發現了lncRNA H19可以通過調節Notch1啟動子的甲基化程度，下調2個下游基因表達Runx2 和BMP2，從而誘導成骨表達。此外，lncRNA H19基因控制印跡基因網絡(IGN)中胰島素樣生長因子2(IGF2)的表達，在胚胎發育和個體生長過程中有重要作用。Huang等[23]在研究鼻咽癌的發病誘因過程中發現lncRNA FOXD3被沉默后可以增加細胞的鈣離子濃度。由于骨質疏松與鈣離子水平密切相關，且目前有關lncRNA調解鈣離子文獻較少，細胞游離鈣水平是否影響骨質疏松發病有待進一步研究。

3 LncRNA與成骨細胞

成骨細胞在骨形成過程中要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡4個階段，而lncRNA在其中扮演了重要的角色。Pei等[23]在對小鼠LncRNA的研究中發現了lncRNA參與成骨細胞的分化過程，提示LncRNA在成骨細胞分化中扮演著重要的角色。Chen等[8]采用卵巢切除小鼠模型分別在體內和體外誘導成骨，探討了DEPTOR(DEP domain containing mTOR interacting protein)與骨髓間充質干細胞成骨分化的關系并對其lncRNA和mRNA序列進行了研究。最終揭示了DEPTOR參與骨質疏松的發病，并且在骨質疏松骨中有較高的表達。Xu等[24]發現LncRNA HIF1α-AS1(hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1)不僅可以調節血管平滑肌細胞增殖凋亡過程，還是成骨細胞分化過程的重要中介，可能有助于研發骨質疏松癥的基因療法。Gao等[25]發現LncRNA MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1)在人骨髓間充質干細胞中增加了成骨相關轉錄因子的表達，通過競爭性結合miR-143抑制miR-143的表達，從而導致成骨分化。但是，LncRNA MALAT1在人骨髓間充質干細胞分化和骨質疏松發病中的作用尚不清楚。Wang等[26]研究了lncRNA MEG3在絕經后骨質疏松中的功能，發現了絕經后骨質疏松患者的骨髓間充質干細胞中MEG3和miR-133a-3p的表達明顯增加，而MEG3過表達逆轉了成骨誘導下調miR-133a-3p的過程，同時SLC39A1表達顯著下降，最終導致骨髓間充質干細胞誘導的PMOP成骨分化受到抑制，進而促進了骨質疏松的發生。Peng 等[27]通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的基因表達進行了測定，發現LncRNA NTF3-5可以通過下調miR-93-3p促進成骨分化和骨再生。Jin等[28]發現LncRNA MIAT的下調可以增強人脂肪源性干細胞(hASCs)的成骨分化，首次揭示了MIAT在hASCs成骨分化中的表達譜，為骨組織工程提供了實驗依據。LncRNA-H19最初被認為是一種成骨促進劑，Huang等[29]發現LncRNA-H19在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中，存在著明顯的表達上調，可以促進體外成骨細胞的增殖，LncRNA-H19過表達誘導人骨髓間充質干細胞體外成骨分化，促進體內異位骨形成。Bu等[30]探討了LncRNA TSIX/miR-30a-5p軸在顆粒誘導骨溶解中的作用，發現TSIX負調控miR-30a-5p的表達，而miR-30a-5p可調節成骨細胞在體內和體外的凋亡。Linc-ROR是一個2.6 kb的LncRNA，是多能干細胞重編程的關鍵調控因子，其上調與人骨髓間充質干細胞成骨分化有關，LncRNALincROR的下調可以阻斷人骨髓源性間充質干細胞的成骨分化[31]。

通過對LncRNA在成骨分化中的作用機制研究，探究細胞分子信號通路，有望從基因角度調節細胞分化方向，提高成骨分化效率，對骨質疏松的治療以及骨組織工程學的臨床應用意義重大。

4 LncRNA與破骨細胞

破骨細胞來源于造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSCs)中的單核巨噬細胞系分化而來，其主要功能為局部泌酸以及釋放骨基質降解酶完成骨的吸收和降解從而維持骨穩態。在破骨細胞相關的研究中，尤其是LncRNA在破骨細胞分化、融合、功能的研究非常缺乏。隨著LncRNA的研究不斷深入，越來越多的學者也開始關注lncRNA在破骨細胞中的調節機制。竇策等[32]首次報道了破骨細胞形成過程中lncRNA、mRNA、circRNA以及miRNA的表達譜，為探索破骨細胞分化機制提供了借鑒。Tong等[33]通過qRT-PCR分析發現低BMD患者的骨單核細胞內LncRNA DANCR存在顯著的上調，提示LncRNA DANCR可以誘導骨單核細胞中IL6和TNF-a的表達，影響破骨細胞骨重塑過程。LncRNA DANCR參與骨質疏松癥的病理學，可能成為絕經后骨質疏松癥的生物標志物。Lee等[34]通過對破骨細胞分化過程中LncRNA和mRNA的分期特異性表達進行了分析后發現，LncRNA-jak3可以通過促進破骨細胞因子Nfatc1(nuclear factor of activated T-cells 1)的表達，誘導成骨細胞分化，證實LncRNA-jak3通過jak3/Nfatc1/Ctsk軸在破骨細胞分化中起著關鍵的功能。Chuan等[35]通過qPCR驗證后發現Lnc-AK077216在骨形成過程中存在高表達，可抑制NIP45表達，促進NFATc1的表達，而NFATc1是破骨細胞生成過程中的重要轉錄因子，進而調控破骨細胞的形成。

到目前為止，有關破骨細胞相關的lncRNA研究仍十分有限，缺乏其深入的研究。精確調控破骨細胞分化的各個階段，對臨床上治療骨質疏松及破骨細胞相關疾病具有重要意義。

5 總結與展望

LncRNA日益被公認是具有眾多生物功能的關鍵調控分子。自LncRNA在哺乳動物中首次被證實存在以來，LncRNA的研究成為了目前研究的熱點，有關LncRNA的生物功能被不斷的發現也取得了重大的進展。盡管骨質疏松與LncRNA的生物學相關性被不斷報道，但是目前的研究還多局限于轉錄組的研究，有關骨質疏松發病的確切的機制仍未完全了解。隨著科學的不斷進步，未來的骨質疏松癥的治療方案將有望提升到基因水平，可能通過操縱LncRNA表達水平來調節成骨細胞和破骨細胞的生物學功能。目前有關骨質疏松相關的LncRNA研究還很有限，LncRNA的深入研究不僅有助于了解骨質疏松癥的分子生物學機制、提供新的生物學標志物，也對疾病的診斷、治療及預后提供新的方式和手段。