主動外排系統RND家族最新研究進展

王 惠， 馮 媛， 王崇剛

我國是面臨細菌耐藥性威脅最為嚴重的國家之一。在所有耐藥病原體中，糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬細菌（ESKAPE）占醫院感染的大多數，且耐藥率持續增長[1]。根據2017年CHINET中國細菌耐藥監測數據表明革蘭陰性菌檢出率約占70%[2]，其耐藥性日趨嚴重。抗藥性起源多且復雜，而多藥耐藥通常與外排泵相關。革蘭陰性菌以多種方式適應抗菌藥物的選擇壓力，包括外排泵的（過）表達。目前，已經鑒定了6類外排泵家族[3]，包括僅存在于革蘭陰性菌的抗性-結瘤-細胞分裂（RND）超家族[4]，外排泵RND家族參與細菌的生理、代謝及致病[5-6]，并在介導多藥耐藥中發揮重要作用。本文主要介紹臨床常見革蘭陰性菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌外排泵的結構、生理功能及在生物膜形成中的作用等最新進展，為外排泵抑制劑的研發提供新思 路。

1 外排泵結構

RND轉運蛋白家族由蘑菇狀同源三聚體的內膜轉運蛋白（IMP）、漏斗狀六聚體的周質融合蛋白（MFP）和同源三聚體的外膜外排蛋白（OEP）組成。MFP位于周質空間橋接IMP和OEP，IMP利用質子梯度通過質子/底物反轉運機制驅動底物排入到OEP中。以下將分別闡述3種細菌的外排泵RND家族結構。

1.1 大腸埃希菌

RND超家族的AcrAB-TolC復合體是大腸埃希菌的主要外排泵[7]，該泵組件包括外膜通道蛋白TolC，位于內膜的轉運蛋白AcrB和周質蛋白融合蛋白AcrA。外排泵各個亞基之間相互作用且在泵內組織，直到AcrAB-TolC復合物的第一個偽原子結構（pseudo-atomic structure）公布[8]，泵的整體形狀以及其組成的相對排列，通過電子顯微鏡研究得以揭示[9-10]，詳細描述了處于靜止狀態和藥物傳輸狀態完整的AcrAB-TolC組裝以及相關的三級和四級結構變化[11]。正如Du等[8]提出，AcrB與TolC之間沒有直接的相互作用，但AcrA與兩者都分別作用。近期研究通過低溫電子斷層掃描術（cryo-ET）證實了AcrAB-TolC外排泵的結構，提出在存在抗生素的情況下，AcrAB復合體通過改變其構象募集TolC[12]。肽聚糖在AcrAB-TolC的組裝過程中起重要作用，AcrA的α-發夾結構域與肽聚糖結合有助于維持AcrAB復合體在細胞包膜中的穩定性，同時當 AcrB與底物結合時有助于TolC與AcrAB復合體連接，證實了AcrAB-TolC泵的結構及其在天然細胞膜環境中的中間組裝狀態，提出可以通過干預AcrA與肽聚糖或AcrB之間的相互作用而阻斷AcrAB-TolC的組裝。

1.2 銅綠假單胞菌

迄今已知，銅綠假單胞菌中至少存在12種RND型，MexAB-OprM和MexXY-OprM是細菌在感染機體過程中存活和產生固有耐藥性的主要外排系統[13]。MexAB-OprM是與大腸埃希菌AcrABTolC同源的系統，由內膜蛋白MexB、外膜蛋白OprM和周質膜融合蛋白MexA三部分組成。AcrB和MexB的氨基酸序列同源性為70%，AcrA和MexA的同源性為57%，TolC和OprM的同源性為19%[14]。過去認為MFP和IMP形成高度特異性結合，不允許同源泵之間相互交換。例如，MexA和MexB在功能上不能與該菌中的任何其他多藥耐藥外排泵系統互換[15]，然而已有研究報道MexB與AcrA和TolC的功能相互作用，Daury等[10]發現組裝過程中將MexB與AcrB互換時，可組裝AcrAMexB-TolC復合物，但與原復合物的形成相比發生率較低，提出可能存在通用的機制觸發外排泵的組裝，形成效率取決于MFP的結合親和力，由此可通過阻止蛋白質/蛋白質識別或通過阻礙其結構適應性影響泵效率，為外排泵抑制劑提供新思路。Lopez等[16]對MexA-OprM組裝研究發現，OprM需要與MexA組裝成藥物結合樣構象才能打開OprM周質孔，同樣也需要通過周質結構域和外部結構域之間的相互作用來介導MexB開放并使整個泵正常工作。最近Tsutsumi 等[17]研究也證實OprM與MexA具有協同作用，通過開放周質孔而被激活。該團隊構建完整的MexAB-OprM泵模型，提出MexA-MexB復合物比MexA-OprM復合物更穩定，并且MexA可能在OprM之前與MexB形成復合物，目前尚需要進一步的動態結構研究[例如分子動力學（MD）模擬]予以驗證。

1.3 鮑曼不動桿菌

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌在我國分離率最高可達90%[2]。鮑曼不動桿菌RND家族主要外排泵是AdeABC、AdeFGH和AdeIJK。Su等[18]研究發現脂質分子在AdeB三聚體的內部表面形成一個環并結合在細胞質膜小葉上，其可能參與了AdeB三聚體的穩定作用，該研究還提出質子的流入和藥物的流出在轉運周期內是相互協調并同步進行 的。

2 外排泵的生理功能

2.1 外排泵介導的固有耐藥

細菌固有耐藥是指其通過固有的結構或功能特性降低特定抗生素功效的能力[19]，RND外排泵家族是革蘭陰性菌多藥耐藥的重要原因，如AcrAB-TolC外排泵具有底物廣泛的特異性，能夠排出多種化合物，包括β內酰胺類、四環素類、氟喹諾酮類、利福平類抗菌藥物等[20]。AdeABC外排泵系統介導了對多種抗菌藥物的抗藥性，過去研究認為臨床分離株中的多藥耐藥表型是由于其過表達引起的，如Yoon等[21]在具有免疫功能的小鼠全身及肺部感染模型中，對鮑曼不動桿菌體內適應性和毒力進行了評估，僅在腹膜內接種后才觀察到過表達AdeABC鮑曼不動桿菌在宿主中的適應性降低，而在鼻內接種后則沒有觀察到，表明鼻內感染對小鼠更具毒性并刺激增強肺中性粒細胞活化，該研究解釋了呼吸機相關性肺炎常見于AdeABC外排泵過表達的原因。但近期研究證明外排泵在抗生素耐藥性中的作用更為復雜并取決于特定的生理環境，外排泵對鮑曼不動桿菌的耐藥性作用僅限于少數幾種抗生素，并且流出泵過量生產對抗生素敏感性的影響是明顯低于先前報道的臨床分離株[22-23]，表明涉及額外的抗性機制，特別是改善細菌細胞的滲透屏障并與主動外排泵協同作用的機制[24]。

近年有文獻報道外排泵表達在細胞間差異的重要性[20，25]。例如，在大腸埃希菌中，AcrAB-TolC泵異質分配，泵聚集在舊極點，表現出對母代細胞的偏倚，導致外排泵表達較高的細胞亞群中的抗性水平升高[25]。RND外排泵在慢性細菌感染中也發揮重要作用，Pu等[20]發現編碼外排泵的基因包括tolC、acrA和acrB，在持留菌中表達更高，且主動外排要先于主動休眠，同時進一步證實了TolC表達與細菌持久性生存呈正相關，而這種瞬時抗藥性機制在持留菌頑固性和反復感染中起關鍵作用。

2.2 外排泵介導的獲得性耐藥

細菌可以通過瞬時耐藥機制使細菌暫時耐藥，即細菌通過休眠進行“被動防御”、利用外排泵來泵出抗生素進行“主動防御”，也可以通過基因突變或水平基因轉移獲得耐藥基因[26]，從而增加細菌在抗生素應用下的適應性。耐藥性的獲得極大地促進了多重耐藥菌株的產生，增加了抗感染治療的難度。

2.2.1 基因突變 研究發現細菌耐受性（tolerance）要先于耐藥性，在持久性狀態下，耐受細胞抗性基因突變概率增加[27]，其機制與外排泵相關：大腸埃希菌AcrAB-TolC水平升高導致DNA錯配修復基因mutS表達降低，MutS降低會造成錯配修復（MMR）和短補丁修復（VSP）系統功能缺陷或降低，同時MutS可抑制RecA介導的鏈轉移，mutS表達降低的細胞在種間雜交中重組增加[28]。Ei Meouche等[29]發現大腸埃希菌AcrABTolC外排泵表達水平較高的細胞具有DNA錯配修復基因mutS表達較低、生長速率降低以及突變頻率增加。證實了AcrAB外排泵表達升高引起的瞬時抗藥性可以促進單個細胞內的自發突變，表明細胞間外排泵表達異質性除了在瞬時抗藥性中產生差異，還會導致自發突變率的差異。目前尚不清楚mutS是由AcrAB-TolC直接調控，還是AcrAB調控或兩者共同調控。

2.2.2 基因水平轉移 細菌耐藥性的傳播主要方式是耐藥基因的水平轉移，最常見的是從環境中其他細菌獲得的染色體外元件，如質粒、轉座子和整合子等。Nolivos等[30]利用熒光顯微鏡成像系統觀察大腸埃希菌在單細胞水平質粒的轉移，該質粒攜帶有編碼TetA外排泵（主動外排四環素）的tet操縱子及調節tetA表達的TetR阻遏物。研究發現在四環素存在的情況下，（36.2±12.5）%敏感受體菌株仍可獲得四環素耐藥性，表明盡管四環素對蛋白質合成有抑制作用，但獲得質粒后受體菌仍可合成TetA外排泵。進一步研究發現AcrAB-TolC外排泵能有效降低敏感菌中四環素的濃度，確保從新獲得的質粒中合成TetA泵。該團隊同時檢測了其他底物如利福平（抑制轉錄）和氯霉素或紅霉素（抑制翻譯）等，證實了AcrABTolc外排泵減輕藥物對F質粒轉移后耐藥基因表達的抑制作用，包括質粒ssDNA轉化為dsDNA，抗性基因轉錄為mRNA以及蛋白質合成。

2.3 外排泵在生物膜形成的作用

生物膜的形成在鮑曼不動桿菌感染宿主中起著重要作用，還導致醫療設備相關感染。多項研究發現與浮游狀態相比，形成生物膜狀態細菌的外排基因表達增加[31]，后者比前者對抗生素的耐受性高。研究表明外排泵的缺失或抑制與生物膜形成明顯減少有關[22]，生物膜是細菌耐藥的重要組成部分，外排泵在其形成中起到重要作用，一項研究表明RND超家族的AcrB和MdtABC泵有助于維持生物膜[32]。缺失acrB和mdtABC基因的突變株在4 h時可正常形成生物膜，隨著時間推移生物膜逐漸減少并在24 h內明顯減少，實驗表明AcrB和MdtABC不參與外排生物膜形成所需的底物，但它們外排維持生物膜所必需的信號因子。 最近，Bay等[33]發現與野生株相比，缺乏acrB、acrA和tolC基因的大腸埃希菌突變株對生物膜生長有明顯抑制作用，并對抗菌藥物的敏感性更高。 He等[34]報道，鮑曼不動桿菌臨床分離株形成的生物膜與AdeFGH外排泵的過表達有關。

生物膜形成的調控主要取決于群體感應系統，大部分革蘭陰性菌的群體感應系統是由雙組分LuxI/R型信號系統調控，該系統產生兩種主要AHL（N-酰基-L-高絲氨酸內酯）信號分子，即3OC12-HSL（3-氧代十二烷酰高絲氨酸內酯）和C4-HSL（N-丁酰高絲氨酸內酯）。外排泵在生物膜形成所需的群體感應信號分子運輸中發揮作用，一項經典研究發現用疊氮化物（胞質膜質子梯度抑制劑）處理過的野生型銅綠假單孢菌細胞內蓄積大量3OC12-HSL，此外，缺乏MexABOprM外排泵的銅綠假單胞菌突變體也顯示出3 OC12-HSL的細胞內強蓄積性并減少了生物膜形成，這項研究表明3OC12-HSL是MexAB-OprM的天然底物并參與其外排[35]。另一項研究也證實分別編碼生物膜發育所需的AHL和AdeFGH外排泵的abaI和abeG基因上調，AdeFGH外排泵的過表達可能會加速AHL在生物膜形成期間的外排[36]。提示可使用外排泵抑制劑與抗菌藥物聯合，以減少致病菌在肺中的定植。

3 展望

外排泵RND家族對于革蘭陰性菌的生存至關重要，其參與細菌群體感應、毒力及生物膜的形成、參與細菌耐藥基因的水平轉移及基因突變、參與細菌瞬時和持久耐藥性等，因此外排泵抑制劑主要通過與競爭性抑制轉運蛋白的結合位點、干擾外排泵蛋白的組裝、阻斷供能效應、抑制底物通過外排泵通道等機制，可恢復其對抗菌藥物敏感性、防止新的突變株出現以及減少生物膜形成。近年來外排泵抑制劑得到廣泛研究，例如吡喃吡啶、擬肽類和吲哚衍生物等[37-38]，到目前為止還沒有臨床獲批的外排泵抑制劑，主要原因是體內藥效低、藥動學性質差及毒性問題，同時細菌存在多種外排泵且底物廣譜，為開發有效的外排泵抑制劑帶來了難題。