基因組規(guī)模代謝模型在細(xì)菌感染治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展

卞星晨， 劉笑芬， 馮美卿， 張 菁，*

基因組規(guī)模代謝模型（ genome-scale metabolic model，GSMM） 是通過整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、文獻(xiàn)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)，建立基因-蛋白質(zhì)（酶）-生化反應(yīng)關(guān)聯(lián)組成的特定微生物代謝網(wǎng)絡(luò)[1]。GSMM將從基因組獲得的生化反應(yīng)信息與代謝表型進(jìn)行橋接，為從系統(tǒng)上理解微生物生理代謝功能模型提供一個(gè)高效平臺(tái)[2]。GSMM最初主要應(yīng)用于工業(yè)微生物制造領(lǐng)域，具體包括①分析代謝網(wǎng)絡(luò)屬性；②預(yù)測(cè)和分析微生物生長(zhǎng)表型；③基于模型的組學(xué)數(shù)據(jù)闡釋；④系統(tǒng)代謝工程[2]。近幾年，GSMM逐漸應(yīng)用于細(xì)菌感染治療領(lǐng)域，Oberhardt等[3-4]通過GSMM的建立，闡釋了病原菌的感染過程和致病機(jī)制，提出該建模方法不僅可創(chuàng)新性用于新靶標(biāo)抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)，還有助于更好地理解疾病的發(fā)病機(jī)制，優(yōu)化治療策略。本文就基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及其在抗感染治療領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為抗感染治療及新藥開發(fā)提供參考。

1 GSMM的構(gòu)建

GSMM構(gòu)建通常包括以下4個(gè)部分[5]。

1.1 粗略模型的構(gòu)建（creating a draft reconstruction）

首先需通過基因組測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得所研究微生物的基因組注釋信息，結(jié)合生化反應(yīng)或代謝通路信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，如KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， https：//www.genome.jp/kegg/），MetaCyc （Metabolic Pathway Database， https：//metacyc.org/），構(gòu)建初步的代謝網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)予注意的是，僅僅依據(jù)基因組信息構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)往往是不完整和不全面的，需要后續(xù)的手工修正以完善代謝網(wǎng)絡(luò)。

1.2 重構(gòu)模型的手工修正（manual reconstruction refinement）

由于并非所有來源于數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋可信度都很高，且用于獲得注釋信息的數(shù)據(jù)庫(kù)并不具有種屬特異性，基因組數(shù)據(jù)注釋過程中往往包含了許多非目標(biāo)微生物的信息，而缺失了部分實(shí)際存在的代謝物及代謝反應(yīng)，需根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行補(bǔ)充修正，該過程稱為模型的手工修正。手工修正對(duì)于后期模型的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)十分必要，經(jīng)完善的模型對(duì)于代謝物之間相互關(guān)系的描述更為準(zhǔn)確和細(xì)致。

1.3 重構(gòu)的代謝網(wǎng)絡(luò)向數(shù)學(xué)模型的轉(zhuǎn)化（conversion from reconstruction to mathematical model）

粗略的GSMM的重構(gòu)依賴于流平衡分析（flux balanced analysis， FBA）[6]，F(xiàn)BA的目標(biāo)就是獲得基于約束的最優(yōu)解空間。該分析借助Matlab軟件中的COBRA （constraint-based reconstruction and analysis）工具包[7]，將代謝反應(yīng)用計(jì)量學(xué)矩陣表示，代謝流用向量表示，模型的約束條件通常是物質(zhì)守恒與能量守恒。為了解微生物在不同生理?xiàng)l件或外界因素干擾下（微生物生長(zhǎng)的不同生命周期，生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否充足，疾病的不同階段，藥物對(duì)微生物的作用）的代謝調(diào)控，通常基于其在不同條件下的基因表達(dá)水平，定義代謝流的邊界，用以對(duì)模型進(jìn)一步約束，從而縮小解空間，提高數(shù)學(xué)模型在真實(shí)情況下的預(yù)測(cè)能力 [8-9]。

整合基因表達(dá)數(shù)據(jù)的算法包括GIMME （gene inactivity moderated by metabolism and expression）、iMAT（integrative metabolic analysis tool）、MADE（metabolic adjustment by differential expression）、E-Flux、PROM（probabilistic regulation of metabolism）等[10]，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，比如GIMME算法只需要一個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，但需要用戶設(shè)定閾值，判斷基因表達(dá)變化，MADE算法無需設(shè)定閾值，但需要多重基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)集，因基因表達(dá)水平是一個(gè)連續(xù)的變量，E-Flux算法避免將表達(dá)數(shù)據(jù)分類為表達(dá)或不表達(dá)這種二進(jìn)制形式，更符合真實(shí)情況，可根據(jù)實(shí)際需求選用合適的算法[11]。

1.4 模型的評(píng)估（evaluation of the model）

在模型評(píng)估過程中，通過重復(fù)1.2和1.3步驟，尋找重構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中缺失的一些代謝反應(yīng)，通過大量全面的文獻(xiàn)檢索補(bǔ)齊這些網(wǎng)絡(luò)漏洞。需要注意的是，在填補(bǔ)代謝漏洞的過程中，新添加到代謝網(wǎng)絡(luò)中的生化反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致新漏洞出現(xiàn)。因此，當(dāng)加入新的反應(yīng)時(shí)，應(yīng)確保所有代謝物能連接到已構(gòu)建好的代謝網(wǎng)絡(luò)。

除需要補(bǔ)齊網(wǎng)絡(luò)漏洞外，也應(yīng)對(duì)GSMM的實(shí)用性進(jìn)行評(píng)估，比如是否在不同培養(yǎng)基中合成細(xì)菌生長(zhǎng)所需的前體物質(zhì)；典型培養(yǎng)基上能否生長(zhǎng)；能否反映單一基因敲除的細(xì)菌生長(zhǎng)表型；已知的與預(yù)測(cè)的生理特性的比較；合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物的能力及其合成速率[12]。

經(jīng)過模型的評(píng)估與修正，GSMM 構(gòu)建的最后一步則是將生化反應(yīng)可視化。可視化軟件包括Adobe Illustrator、Cell Designer （http：//celldesigner.org/）等。

由于GSMM的構(gòu)建需要多達(dá)96個(gè)步驟，為加速新模型的建立，已開發(fā)出一些程序，使建模過程趨向于自動(dòng)化，如基于網(wǎng)絡(luò)資源的模型SEED（http：//www.theseed.org/）[13]，該模型的核心為一個(gè)模型重構(gòu)管線，它整合了基因組注釋技術(shù)、基因-蛋白反應(yīng)（gene-protein-reaction， GPR）構(gòu)建、生物量產(chǎn)生反應(yīng)、反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)集、反應(yīng)可逆性的熱力學(xué)分析以及模型的優(yōu)化[14-15]。其他自動(dòng)化建模工具還包括有Path2Models （https：//www.ebi.ac.uk/biomodels-main/path2models）[16]、CarveMe（https：//pypi.org/project/carveme/）[17]等。

2 通過GSMM揭示細(xì)菌感染機(jī)制

GSMM在工業(yè)微生物領(lǐng)域的應(yīng)用已較為廣泛，近年來才逐漸應(yīng)用于抗感染領(lǐng)域。Oberhardt等[3]在2008年建立了銅綠假單胞菌PAO1的代謝模型，從而對(duì)該病原菌的基因型和表型關(guān)系有了更深的理解。該課題組選取了囊性纖維化肺部感染患者，對(duì)銅綠假單胞菌在感染進(jìn)程中的代謝網(wǎng)絡(luò)加以分析，揭示了在囊性纖維化肺中，銅綠假單胞菌如何通過代謝改變以適應(yīng)環(huán)境[4]，探討銅綠假單胞菌的致病機(jī)制，即在宿主的定植與感染機(jī)制。在模型構(gòu)建完成后，模擬每個(gè)基因的敲除，鑒定出不同感染進(jìn)程中顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或致死的基因，由此可根據(jù)疾病進(jìn)程，針對(duì)特異性基因靶點(diǎn)選擇更合適的治療方案。

由于細(xì)菌在體內(nèi)的生存、感染與定植主要與生長(zhǎng)必需基因和毒力因子的產(chǎn)生相關(guān)，多數(shù)抗菌藥物的作用靶點(diǎn)通常作用于細(xì)菌生長(zhǎng)過程，但這種靶向作用易產(chǎn)生耐藥。Bartell等[18]提出毒力相關(guān)通路可能成為治療靶點(diǎn)，且不易產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥。在預(yù)測(cè)的116個(gè)生長(zhǎng)必需基因中，46個(gè)基因同時(shí)為毒力因子合成所必需，其中6個(gè)脂肪酸和磷脂代謝基因（aacA、aacB、aacC、aacD、fabD、fabG）對(duì)毒力因子的合成影響最為顯著。這種基于機(jī)制的模型定量分析揭示了基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)和毒力的影響，不僅僅減少了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間，也為開發(fā)新治療策略提供了思路和方向。

銅綠假單胞菌易在醫(yī)療植入物[19]以及囊性纖維化患者的肺部[20]形成生物膜，但其生物膜形成機(jī)制仍不清楚。Biggs等[21]借助GSMM，結(jié)合已有的基于Agent仿真建模（agent-based model， ABM）的生物膜形成模型，揭示銅綠假單胞菌生物膜形成活性是氧依賴性的，在氧缺乏時(shí)，添加硝酸鹽可緩解這種氧依賴機(jī)制，促進(jìn)無氧呼吸進(jìn)而增加生物膜的形成，與實(shí)際情況相符[22]。Vital-Lopez等[23]在PAO1的GSMM基礎(chǔ)上構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)合基因表達(dá)譜，研究銅綠假單胞菌在形成生物膜狀態(tài)下的代謝，根據(jù)相關(guān)代謝物的濃度變化預(yù)測(cè)特異性的針對(duì)生物膜形成的目標(biāo)反應(yīng)，進(jìn)而尋找特異性基 因。

在抗菌靶標(biāo)尋找中，Sigurdsson等[24]首次運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法，通過模擬與生物膜形成相關(guān)的微環(huán)境，發(fā)掘清除銅綠假單胞菌生物膜的候選基因。由于病原菌可能在被清除之前就形成了生物膜，有必要對(duì)必需基因發(fā)生突變的菌株的生物膜形成能力進(jìn)行評(píng)估。只有當(dāng)必需基因的突變不誘導(dǎo)生物膜形成時(shí)方可將其作為藥物作用靶標(biāo)，故Xu等[25]通過模型模擬對(duì)突變株生物膜形成進(jìn)行定量預(yù)測(cè)。有趣的是，通過系統(tǒng)水平的建模，發(fā)現(xiàn)必需基因的突變相比于非必需基因更易誘導(dǎo)生物膜形成，最終確定lysC、cysH、adk、galU這4個(gè)基因可作為銅綠假單胞菌的治療靶標(biāo)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也證實(shí)這4個(gè)靶基因與銅綠假單胞菌的生存和毒力有 關(guān)[25]。

3 通過GSMM揭示抗生素作用機(jī)制

GSMM有助于從系統(tǒng)層面了解抗生素作用機(jī)制，反映在抗生素作用下，細(xì)菌的生化反應(yīng)發(fā)生哪些改變。以銅綠假單胞菌為例，多黏菌素類藥物發(fā)揮抗菌活性的機(jī)制與細(xì)菌應(yīng)答之間的關(guān)系仍然存在許多未知，需要借助系統(tǒng)藥理學(xué)的方法進(jìn)行更全面的研究。Zhu等[26]在建立了銅綠假單胞菌PAO1的代謝模型iPAO1的基礎(chǔ)上，將多黏菌素B作用下細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)作為模型的約束條件，建立了基于多黏菌素B作用機(jī)制的模型，不僅揭示銅綠假單胞菌在多黏菌素B作用下發(fā)生的一系列代謝改變，包括生物量合成減少、氨基酸分解代謝上調(diào)、三羧酸循環(huán)的代謝流上調(diào)與氧化還原反應(yīng)的增加，與組學(xué)數(shù)據(jù)互為印證，也能夠預(yù)測(cè)環(huán)境或基因擾動(dòng)引起的代謝改變。模型模擬結(jié)果表明，脂質(zhì)A的修飾與多黏菌素B的耐藥相關(guān)，這一修飾對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響不大，但顯著改變了外膜的生化特征，包括因4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-L-arabinose， L-Ara4N）修飾導(dǎo)致的表面負(fù)電荷的中和，乙酰化和去乙酰化過程帶來的極性和疏水作用改變，這些代謝改變都將影響多黏菌素類藥物與細(xì)菌的相互作用。

Presta等[27]基于多黏菌素E處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，建立了鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19606在多黏菌素E處理前后的GSMM。將未經(jīng)藥物處理和經(jīng)多黏菌素E 2 mg/L處理15 min和60 min的基因表達(dá)數(shù)據(jù)整合入鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606的GSMM中，結(jié)果表明在多黏菌素E的選擇性壓力下，細(xì)菌的必需基因發(fā)生改變。78個(gè)必需基因中，經(jīng)多黏菌素E處理15 min和60 min后66個(gè)基因仍被預(yù)測(cè)為生長(zhǎng)必需基因，由此提出在多黏菌素類藥物作用下具有特異性的藥物作用靶標(biāo)基因，作用于這些靶標(biāo)基因的藥物可能與多黏菌素E產(chǎn)生協(xié)同作用。而事實(shí)上，除轉(zhuǎn)錄調(diào)控以外，代謝調(diào)控也將共同影響細(xì)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)。Zhu等[28]進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)整合到鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606的GSMM中，探究鮑曼不動(dòng)桿菌在多黏菌素E處理后發(fā)生的代謝改變，其中糖異生、磷酸戊糖途徑、氨基酸和核苷酸的生物合成上調(diào)，三羧酸循環(huán)、肽聚糖和脂多糖的生物合成下調(diào)，呼吸鏈代謝流也發(fā)生改變，與代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，這些結(jié)果使我們產(chǎn)生思考：多黏菌素E聯(lián)合一些非抗生素如核苷酸抑制劑是否能產(chǎn)生協(xié)同作用。這種多黏菌素E處理下的代謝改變，從機(jī)制上為優(yōu)化多黏菌素類藥物聯(lián)合用藥方案的制定提供參考依據(jù)。

4 通過GSMM發(fā)現(xiàn)抗菌治療新靶標(biāo)

無論是對(duì)病原菌致病機(jī)制或是對(duì)藥物抗菌機(jī)制的揭示，其價(jià)值均在于發(fā)現(xiàn)特異性治療靶標(biāo)，從機(jī)制上為新藥開發(fā)和治療策略的制定提供依據(jù)。必需基因的預(yù)測(cè)是發(fā)現(xiàn)潛在靶標(biāo)最常用的方法，編碼必需基因的酶通常被假定為藥物靶標(biāo)。若該必需基因或基因產(chǎn)物會(huì)影響某一個(gè)代謝反應(yīng)，基因敲除就可能導(dǎo)致代謝流的重新分布[29]。在不同的疾病階段，病原菌的生長(zhǎng)環(huán)境有所差異，其必需基因也會(huì)受到環(huán)境的影響，因此在不同生長(zhǎng)條件下建立的模型適用于不同疾病階段藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)[30]。除必需基因外，評(píng)估酶的穩(wěn)健性也能夠發(fā)掘代謝網(wǎng)絡(luò)中易受影響部分，將其作為潛在藥物靶標(biāo)。模擬反應(yīng)流部分抑制到完全抑制對(duì)目標(biāo)流如生物量產(chǎn)生的影響，揭示在酶催化反應(yīng)抑制的條件下代謝網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)健性[31]。若酶的失活引起某些毒性中間體累積，毒性中間體對(duì)病原菌有致死作用，那么這些酶也將會(huì)成為更具潛力的藥物靶標(biāo)[32]。由于一些藥物與天然代謝物高度相似，這些藥物可競(jìng)爭(zhēng)或抑制酶的活性[33]，因此預(yù)測(cè)必需代謝物也有助于發(fā)現(xiàn)藥物新靶標(biāo)。與必需基因的預(yù)測(cè)方法類似，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌而言，預(yù)測(cè)出9個(gè)必需代謝物[34]，這些必需代謝物合成或消耗所需的催化酶將成為可能的靶標(biāo)。

許多抗感染藥物是多靶點(diǎn)的，多靶點(diǎn)作用不易產(chǎn)生耐藥[35]，運(yùn)用FBA能夠快速預(yù)測(cè)多個(gè)基因或代謝反應(yīng)擾動(dòng)的影響[36]。聯(lián)合用藥也相當(dāng)于是一種多靶點(diǎn)策略，為篩選得到具有協(xié)同作用的聯(lián)合用藥方案，選取已知或可能的藥物靶標(biāo)，逐漸限制其代謝流，觀察相應(yīng)的發(fā)生流增加的代謝反應(yīng)，在這些通路中尋找有協(xié)同作用的藥物新靶標(biāo)[32]。或者在GSMM的基礎(chǔ)上，整合藥物處理后病原菌的基因表達(dá)信息，建立特定條件下的代謝模型，據(jù)此預(yù)測(cè)的靶標(biāo)可能與該藥物產(chǎn)生協(xié)同作 用[27]。

5 總結(jié)

綜上所述，GSMM的構(gòu)建有助于理解病原菌的致病機(jī)制、藥物的作用機(jī)制以及耐藥產(chǎn)生，在新藥研發(fā)中，將模型預(yù)測(cè)整合到新藥研發(fā)管線中，基于預(yù)測(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將大大加快抗感染治療藥物的研發(fā)和治療策略的制定。