弓形蟲病診斷方法研究進(jìn)展

（長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，吉林長(zhǎng)春 130062）

弓形蟲病（toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplsma gondii）引起的呈世界性分布的嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病[1]。弓形蟲主要寄生在細(xì)胞內(nèi)部，人類通過進(jìn)食未煮熟的含有弓形蟲卵囊的食物或者被污染的水源而感染[2-3]。健康人群感染后無明顯的臨床癥狀，但是免疫功能低下的人群感染后則會(huì)引起嚴(yán)重的后果：孕婦感染后會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)，產(chǎn)弱胎、畸胎、死胎等；器官移植的病人，由于免疫抑制劑的使用導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，感染后病原會(huì)在多個(gè)器官迅速增殖，導(dǎo)致機(jī)體功能衰退。弓形蟲感染是艾滋病患者中常見的機(jī)會(huì)性感染，感染引起的免疫抑制使?jié)摲腥驹偌せ顚?dǎo)致嚴(yán)重的甚至可能致命的腦炎[4]。弓形蟲病不僅對(duì)人類的健康存在著威脅，也給畜牧產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2004 年，弓形蟲病曾在我國(guó)的豬場(chǎng)大肆流行，死亡率高達(dá)60%，嚴(yán)重影響了當(dāng)時(shí)的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)[5]。不僅如此，此病會(huì)使懷孕動(dòng)物出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，還會(huì)使患病動(dòng)物死亡，對(duì)動(dòng)物健康造成了極大威脅。該病目前無有效治療藥物，早期確診是有效的控制手段之一。本文從病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方面，綜述了各診斷技術(shù)的研究進(jìn)展以期為疫病診斷方法的選擇提供參考。

1 病原學(xué)診斷

目前常用的弓形蟲病檢測(cè)方法為顯微鏡鏡檢和動(dòng)物接種。顯微鏡鏡檢是選取樣本的病變部位或者將糞便和水中的卵囊過濾之后涂片、固定并使用吉姆薩染色和HE 染色方法對(duì)包囊染色，最后觀察結(jié)果[6]。Khademvatan 等[7]通過顯微鏡對(duì)伊朗的多只嚙齒動(dòng)物涂片進(jìn)行了弓形蟲病檢測(cè)，結(jié)果有1 例感染了弓形蟲病；利用PCR 方法檢測(cè)出弓形蟲陽(yáng)性樣品41 份；血清學(xué)方法檢測(cè)弓形蟲抗體陽(yáng)性率與PCR 方法檢測(cè)結(jié)果相近。這說明鏡檢方法雖然可直接觀察到病原，但檢出率較低，不適合作為單一方法用于檢測(cè)弓形蟲病原。除此之外，動(dòng)物接種法也常應(yīng)用于弓形蟲診斷，該方法將病料接種至易感動(dòng)物體內(nèi)或通過細(xì)胞培養(yǎng)等方式對(duì)弓形蟲進(jìn)行檢測(cè)。孫新[8]利用小鼠腹腔接種和THP21 細(xì)胞培養(yǎng)的方法，對(duì)30 頭孕鼠的羊水進(jìn)行弓形蟲分離鑒定，共分離得到6 株弓形蟲，細(xì)胞培養(yǎng)組平均陽(yáng)性時(shí)間8 d，而接種組平均陽(yáng)性時(shí)間為9 周，檢測(cè)所需時(shí)間都較長(zhǎng)。病原學(xué)診斷方法雖然操作簡(jiǎn)便，但步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低等，無法滿足高效、快速的檢測(cè)需求，因此在實(shí)驗(yàn)室診斷方面應(yīng)用較少。

2 免疫學(xué)診斷

免疫學(xué)診斷方法目前常被應(yīng)用于弓形蟲病檢測(cè)，其中包括染色試驗(yàn)（sabin-feldman dye test，DT）、凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。

2.1 染色試驗(yàn)（DT）

染色試驗(yàn)于1948 年首次創(chuàng)立，只適用于弓形蟲感染，特異性較強(qiáng)[9]。染色試驗(yàn)是通過弓形蟲分別與陰性和陽(yáng)性血清作用后，根據(jù)堿性美藍(lán)液染色結(jié)果判斷被檢體內(nèi)是否含有弓形蟲抗體。趙恒梅等[10]通過該方法對(duì)11 份陽(yáng)性兔血清和34 份弓形蟲病人的血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率分別為100%和94.1%，并與血吸蟲病、肺吸蟲病、瘧疾等均無交叉反應(yīng)。染色試驗(yàn)由于其特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)曾被稱為最有價(jià)值的檢測(cè)方法，在早期的診斷中被廣泛使用[11]。但此方法使用的抗原必須為活體，且不利于操作，存在著巨大的危險(xiǎn)性，因此被限制使用。

2.2 凝集試驗(yàn)

凝集試驗(yàn)主要包括直接凝集試驗(yàn)（direct agglutination test，DAT）、間接血凝試驗(yàn)（indirect hem agglutination test，IHA）、乳膠凝集試驗(yàn)（latex agglutination test，LAT）、改良凝集試驗(yàn)（mend agglutination test，MAT）。

2.2.1 直接凝集試驗(yàn)（DAT）直接凝集試驗(yàn)是用甲醛固定弓形蟲懸液來作為抗原，與被檢血清直接進(jìn)行反應(yīng)。在載玻片加入稀釋度不同的試驗(yàn)血清，混勻，幾分鐘后在顯微鏡下觀察，如果發(fā)生凝集現(xiàn)象，則證明為陽(yáng)性，反之為陰性[12]。1991 年，張述義等[13]通過微孔板法建立了檢測(cè)弓形蟲IgG 抗體的直接凝集試驗(yàn)，通過這種方法能檢測(cè)出早期感染的IgG 抗體。

2.2.2 間接血凝試驗(yàn)（IHA）間接血凝試驗(yàn)是利用弓形蟲可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，當(dāng)其與相應(yīng)的抗體產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，可以用肉眼觀察到凝集現(xiàn)象[14]。間接血凝試驗(yàn)比直接凝集試驗(yàn)靈敏性高，特異性強(qiáng)，因而常應(yīng)用該方法進(jìn)行流行病調(diào)查。但間接血凝試驗(yàn)也存在一些不足，包括重復(fù)性比較差，致敏紅細(xì)胞不穩(wěn)定和易發(fā)生非特異凝集等缺點(diǎn)。

2.2.3 乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）乳膠凝集試驗(yàn)是將乳膠顆粒包被可溶性的抗原，加入待檢血清后充分震蕩混勻，室溫過夜后進(jìn)行觀察；如果發(fā)生凝集現(xiàn)象，則證明感染弓形蟲[15]。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察，但費(fèi)時(shí)且特異性不強(qiáng)，在弓形蟲檢測(cè)中不常使用。

2.2.4 改良凝集試驗(yàn)（MAT）改良凝集試驗(yàn)是由Dubey 和Desmonts 于1987 年在直接凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了一種敏感的弓形蟲檢測(cè)方法[16]。Feg 等[17]用此試驗(yàn)方法對(duì)散養(yǎng)的雞群進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)雞群感染率為16.6%。Heddergott等[18]也用此試驗(yàn)方法對(duì)浣熊進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有37.4%的浣熊感染弓形蟲。該方法特異敏感性強(qiáng)，但存在費(fèi)時(shí)、檢測(cè)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA 試驗(yàn)是利用酶的高效催化作用以及底物放大的反應(yīng)原理，提高特異性抗原和抗體免疫反應(yīng)檢測(cè)的敏感性[19]。該方法可以檢測(cè)出弓形蟲感染各個(gè)時(shí)期的IgM、IgG、IgA 和IgE 抗體，敏感性較好。管剛等[20]2008 年用弓形蟲的重組蛋白P30 作為抗原建立了ELISA 方法，并用此方法對(duì)收集的139 份豬血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出陽(yáng)性血清8 份，陽(yáng)性率為5.76%。羅才慶等[21]比較ELISA 和HAT 試驗(yàn)方法，結(jié)果表明ELISA 更適合用于檢測(cè)豬弓形蟲抗體。近年來隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，科研人員又研究出了許多改進(jìn)方法，如葡萄球菌A 蛋白ELISA、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）、PCR-ELISA、雙夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DS-ELISA）等[22]。據(jù)調(diào)查，ELISA 檢測(cè)方法是國(guó)內(nèi)外學(xué)者以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)弓形蟲抗體最常用的方法。目前，已研制出反應(yīng)靈敏、特異性高、重復(fù)性好的動(dòng)物弓形蟲ELISA 試劑盒。如：檢測(cè)弓形蟲 IgM 抗體的間接 ELISA 法試劑盒（該種方法對(duì)于急性病例檢出率較高，但類風(fēng)濕因子陽(yáng)性者易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)），可去除類風(fēng)濕干擾的雙夾心法ELISA 檢測(cè)試劑盒。

2.4 間接熒光抗體試驗(yàn)（FAT）

間接熒光抗體試驗(yàn)是用固定的弓形蟲速殖子制作抗原片，通過熒光素標(biāo)記的二抗檢測(cè)特異性抗體[23]。此方法特異性和敏感性較高，重復(fù)性也很高，在國(guó)外被廣泛應(yīng)用。但我國(guó)利用FAT 方法檢測(cè)弓形蟲的報(bào)道非常少。此試驗(yàn)方法需要用專業(yè)熒光顯微鏡來進(jìn)行觀察，所以在國(guó)內(nèi)沒有大面積推廣使用。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)又被稱為核酸雜交技術(shù)（nucleic acid hybridization），是1968 年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Roy Britten 及同事們所發(fā)明[1，24]。核酸探針技術(shù)作為重要的分子生物學(xué)技術(shù)，通過將特定的病原基因序列分離純化后標(biāo)記作為探針，與待檢的DNA 和RNA 單鏈形成雜交雙鏈，最后將標(biāo)記物洗去，用自顯影技術(shù)對(duì)其檢測(cè)，從而檢測(cè)出與特定序列結(jié)合的核酸樣品，最終達(dá)到檢測(cè)病原的目的。Blanco 等[25]建立弓形蟲RH 株基因文庫(kù)，從中篩選出pTg4 重復(fù)片段。將此片段用放射性同位素32P 標(biāo)記作為探針，可檢測(cè)到80 pg 純化的弓形蟲基因組DNA。由于放射性同位素標(biāo)記的核酸探針容易污染環(huán)境，且對(duì)人體有一定損害，所以在使用上受到一定的限制。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR 技術(shù)可以在比較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)弓形蟲基因組特定的片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)拷貝的靶DNA 分子。Nabi 等[26]對(duì)PCR 方法與顯微鏡法進(jìn)行了比較，對(duì)于檢測(cè)貓糞便弓形蟲卵囊，PCR 檢測(cè)方法更為可靠。Lukasove 等[27]分別收集了南非野鳥、家養(yǎng)鳥的110 份、15 份腦組織樣本，并對(duì)其進(jìn)行了PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2.7%的野鳥感染了弓形蟲。研究表明，PCR 檢測(cè)方法速度快、靈敏度高、結(jié)果可靠。正因如此，PCR 技術(shù)才得以廣泛使用，在弓形蟲病的臨床診斷中占有重要作用。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

LAMP 是Notomi 等人在2000 年開發(fā)的一種等溫核酸擴(kuò)增方法[28]。LAMP 是在BstDNA 聚合酶的參與下，用4 對(duì)引物識(shí)別弓形蟲靶基因的6 個(gè)區(qū)域，在等溫條件下使靶基因高效擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物既可以通過熒光定量、電泳檢測(cè)，也可以通過離心后肉眼觀察沉淀[29]。LAMP 進(jìn)行檢測(cè)時(shí)只需要水浴或者用普通的加熱裝置，就可以直接觀察出擴(kuò)增的產(chǎn)物。因此LAMP 是在沒有精密儀器下，仍能快速、簡(jiǎn)便得出結(jié)果的一種檢測(cè)方法。此方法的靈敏度和擴(kuò)增效率要比常規(guī)的PCR 方法高很多[30]。Zhang 等[31]根據(jù)弓形蟲529 bp 重復(fù)序列建立LAMP 方法，與常規(guī)PCR 方法同時(shí)對(duì)疑似感染弓形蟲的豬淋巴結(jié)樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果LAMP陽(yáng)性率為85.7%，而常規(guī)PCR 陽(yáng)性率為76.9%；Krasteva 等[32]利用弓形蟲單一拷貝的SAG1基因設(shè)計(jì)引物建立了LAMP 診斷方法，對(duì)人工感染弓形蟲小鼠的不同組織樣本進(jìn)行弓形蟲檢測(cè)，并與常規(guī)PCR 方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其靈敏度明顯高于常規(guī)PCR。

4 展望

弓形蟲病是一種人獸共患病，不僅僅對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)人類健康也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。由于該病臨床癥狀缺乏較強(qiáng)的特異性，導(dǎo)致檢測(cè)技術(shù)發(fā)展較慢。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)弓形蟲病研究的重視，未來適合于大量樣品檢測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查的商品化ELISA 方法試劑盒，以及可直接對(duì)多種組織中弓形蟲病原進(jìn)行檢測(cè)的商品化分子生物學(xué)試劑盒將得到進(jìn)一步推廣和應(yīng)用，從而快速、準(zhǔn)確診斷出弓形蟲病原，以達(dá)到預(yù)防控制弓形蟲病，減少經(jīng)濟(jì)損失和保障人類健康的目的。