耐藥基因blaNDM-1和mcr-1在腸道細菌中的研究進展

呂東月，汪照國，王 鑫

1928 年英國微生物學家弗萊明首次發現了世界上的第一種抗生素——青霉素[1]，這是人類歷史上的重大發現?？股氐陌l現使感染性疾病病死率大幅下降，同時感染性疾病并發癥的發病率也顯著降低。但是近年來，抗生素的頻繁使用，出現并加劇了細菌耐藥問題[2]，尤其是革蘭氏陰性細菌中出現了多重耐藥(Multidrug-resistant，MDR)細菌。另外，全球經濟一體化在促進了各國之間的經濟文化交流的同時，也加劇了細菌耐藥問題。如今，細菌耐藥性問題已經成為人類面對的一大公共衛生問題，對人類健康造成嚴重威脅，嚴格控制細菌耐藥性的傳播已迫在眉睫。

2014年4 月30 日，WHO首次發布關注全球抗生素耐藥問題的報告，人類進入后抗生素時代。如今，細菌抗生素耐藥性的發展和傳播是全球衛生和食品安全的最大威脅之一[3]，引起了全世界的關注。2008年以來，各個國家相繼發現碳青霉烯類藥物耐藥基因——blaNDM-1基因和多黏菌素耐藥基因——mcr-1基因。

本文就blaNDM-1基因和mcr-1基因的發現、流行、耐藥機制及檢測方法等方面進行綜述，以期能為嚴格控制抗生素的使用提供理論依據。

1 耐藥基因blaNDM-1和mcr-1的發現

1.1 blaNDM-1基因的發現 blaNDM-1(New Delhi metallo-beta-lactamase 1，blaNDM-1)是一種質粒編碼的全新的β-內酰胺酶。由于其是多藥耐藥和廣譜耐藥，因此又被稱為“超級細菌”。2009年首次發現blaNDM-1基因[4]。2010年，中國研究者在鮑曼不動桿菌中發現了中國首例blaNDM-1基因[5]。

2008 年初，在印度新德里一家醫院里，從一位男患者的尿液標本中分離出了一株肺炎克雷伯菌，該菌對多種抗生素，尤其是碳青霉烯類抗生素耐藥。同年3月在該病人糞便標本中分離出了同樣對碳青霉烯類抗生素耐藥的大腸埃希菌。檢測結果顯示該病人體內分離的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中均存在一種新的金屬β-內酰胺酶(Metallo-β-lactamase，MBL)，可轉移B類β-內酰胺酶。與其他B類內酰胺酶(例如I MP和VI M)相似，而與A、C和D類β-內酰胺酶不同的是，blaNDM-1的活性位點存在鋅離子，而不是絲氨酸殘基[6-8]。由于該患者是在印度首都新德里接受治療時被含該MBL的細菌感染，因此，研究者將其命名為新德里金屬β-內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase)，即blaNDM-1，同時以blaNDM-1來命名編碼NDM-1的基因。blaNDM-1基因開放閱讀框架為813個堿基，編碼269個氨基酸，C-G的含量為57%，可以水解單環類以外的一大類β-內酰胺類抗生素。除了β-內酰胺類外，大多數blaNDM-1陽性細菌對其他類型的藥物均具有廣泛的耐藥性，即幾乎對替加環素和多黏菌素以外的所有抗生素耐藥。blaNDM-1基因是從同一患者不同菌屬細菌分離出來，這表明它可能是可轉移的。由于其強耐藥性和傳播性，blaNDM-1迅速成為全球細菌耐藥相關領域關注和研究的焦點之一?，F在已發現的blaNDM-1基因的亞型有26種。其中，blaNDM-2基因是在鮑曼不動桿菌中獲得的[9];blaNDM-3—blaNDM-7基因在大腸桿菌中被發現10-11];blaNDM-14和blaNDM-15基因是由我國首次發現并命名的[12]。

1.2 mcr-1基因的發現 多黏菌素類抗生素被稱為對抗細菌感染的最后一道防線，常常作為飼料添加劑或治療藥應用于畜牧業。多黏菌素類抗生素的廣泛使用促使了多黏菌素耐藥問題的出現。

2015 年，中國學者在一株豬源性大腸埃希菌SHP45中首次發現了可以讓細菌對多黏菌素產生抗藥性的新基因——mcr-1(Mobile Colistin Resistance-1)[13]。其開放閱讀框為1 626 bp，G-C含量49%，位于Inc Hl2型質粒上。mcr-1基因是質粒介導的黏菌素耐藥基因，可介導腸桿菌科細菌對多粘菌素類藥物產生耐藥性并可通過質粒進行水平轉移。正是因為mcr-1可水平轉移的特性，使耐藥菌廣泛快速傳播，黏菌素耐藥率升高。另外，研究表明mcr-1基因可以與其他耐藥基因共存。這一現象，進一步加劇了細菌耐藥性對人類健康的威脅。隨著研究的深入，mcr-1的亞型mcr-2—mcr-9相繼被發現。Xavier等人發現了多黏菌素耐藥基因mcr-2，開放閱讀框為1 617 bp，與mcr-1的同源性為76.75%[14-15];Yin等人報道了mcr-3，開放閱讀框為162 bp，其與mcr-1和mcr-2分別有45.0%和47.0%的核酸一致性[16];Carattoli A等人在意大利屠宰場的一頭豬中分離到的鼠傷寒沙門氏菌的單相變體并從中發現了mcr-4基因，其與mcr-1、mcr-2和mcr-3分別具有34.0%、35.0%和49.0%的氨基酸序列同一性[17];Maria Borowiak等人在副傷寒沙門氏菌分離物中鑒定到了新的磷酸乙醇胺轉移酶基因，并將其命名為mcr-5，其開放閱讀框為1 644 bp[18]。

2 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的流行情況

2.1 blaNDM-1基因的流行情況 近年來，大多數國家和地區相繼報道了blaNDM-1基因。blaNDM-1耐藥性在全球范圍內呈散發的趨勢，而且病例之間沒有流行病學聯系。2008－2009年在英國、印度、巴基斯坦和孟加拉國進行的一項調查中，發現180余例blaNDM-1基因陽性菌，以肺炎克雷伯菌和大腸桿菌為主。2010年2月至2010年7月，印度一家醫院的blaNDM-1流行率為6.9%[19-20]，在巴基斯坦一家醫院中，有18.5%的住院病人和門診患者的腸道菌群中攜帶blaNDM-1細菌[21]。另外，在醫院的醫療環境及外環境(污水、自來水)中也發現攜帶blaNDM-1的革蘭氏陰性菌[22]。全球范圍內，除了存在于肺炎克雷伯菌和大腸桿菌外，blaNDM-1還存在于不動桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌等大部分革蘭氏陰性菌中。目前，除了非洲中部、南美洲西部個別國家沒有報道，其他國家和地區均呈blaNDM-1耐藥基因全球流行蔓延的趨勢[23]。

我國blaNDM-1陽性病例存在明顯的地區、年齡及性別差異。截至2015年已經有25個省市(含港澳臺地區)報道了blaNDM-1陽性菌株。其中，東南部沿海地區blaNDM-1陽性病例分布較多，廣東地區報道的陽性病例為109例，占39.49%，明顯多于其他地區[24]。研究表明，blaNDM-1陽性菌的感染者中，男性明顯多于女性，年齡分布主要集中在10歲以下和60～80歲之間。這表明，基礎體質和免疫力較差的人群屬于產blaNDM-1細菌感染的易感人群。此外，blaNDM-1基因還存在于伴生動物中，尤其是候鳥。候鳥的遷徙使blaNDM-1基因的水平轉移成為可能，進一步促進了blaNDM-1的全球蔓延。

2.2 mcr-1基因的流行情況 多黏菌素長期用于畜牧業中，主要是多黏菌素B和多黏菌素E，各個國家一直將其用于禽畜的飼料添加劑以及疾病的預防和治療。在全球范圍內生產多黏菌素E的國家中，亞洲的國家占73%。多黏菌素在畜牧業的廣泛應用，促進了mcr-1耐藥基因的傳播。從2015年中國報道mcr-1基因后，美國、英國、加拿大、泰國、丹麥等35個國家也相繼發現了mcr-1基因。2000－2004年，在日本的健康動物中，mcr-1陽性的大腸埃希菌占0.4%[25];2009-2015年，法國、德國和越南分別在豬中檢出攜帶mcr-1的大腸埃希菌，陽性率分別為0.5%[26]、2.3%[27]和37.5%[28];2014年，在埃及的奶牛中，攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌的陽性率為2.6%[29];2016年，在中國廣東的貓和犬中，攜帶mcr-1的大腸埃希菌的陽性率分別為14.3%、10.3%[30]。中國上海的一項2006-2016年回顧性研究中，在12 053株沙門氏菌中，有37株是mcr-1陽性，而且2015年后，陽性率呈上升趨勢[31]。總體來看，部分國家動物源菌株中的mcr-1攜帶率比較低(＜5%)，而中國、越南等國家的mcr-1基因的陽性率較高。

除了在豬、雞、犬等動物體內發現有mcr-1基因外，在動物性食物、水、蔬菜、醫院廢水、患者的痰液、血液、尿液以及傷口分泌物中也檢出mcr-1基因。一項研究表明，2011－2014年間，在中國的523份生肉標本中，mcr-1陽性率為15%，在804份動物體內檢出mcr-1陽性率為21%，在1 322份感染患者體內，mcr-1陽性率為1%[13]。

3 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的耐藥機制

3.1 blaNDM-1基因的耐藥機制 blaNDM-1基因是一種新發現的B類金屬β-內酰胺酶，對該基因進行同源性分析發現，blaNDM-1基因與 VI M 基因較為相似[32]。blaNDM-1基因對除了替加環素和多黏菌素以外的多種抗生素均耐藥，尤其是碳青霉烯類抗生素。blaNDM-1的活性部位為金屬離子，即鋅離子，必須依賴鋅離子的存在才能發揮催化活性，鋅離子對亞胺培南、厄他培南等常見碳青霉烯類抗生素有很強的水解活性，對其產生耐藥性。blaNDM-1基因位于一個耐藥基因元件中，包含Ⅰ類整合子，其上游是基因組DNA，下游還有插入序列IS26和Tn3轉座基因。整合子、轉座子和插入序列是基因轉移的基本元件[33]，因此，耐藥基因blaNDM-1可以通過質粒的轉移，轉移到敏感菌上，使之成為耐藥菌，從而實現了blaNDM-1基因的跨種屬傳播。

3.2 mcr-1基因的耐藥機制 mcr-1位于多種類型的可接合質粒上，可以在不同質粒與不同菌屬間傳播。mcr-1基因主要位于lnc X4和Inc Hl2型質粒上[34]，Inc Hl2、Incl2和l nc P是mcr-1基因的主要質粒[35]。此外，該基因可以與其他耐藥基因同時存在，這會加速mcr-1的轉移和耐藥性的傳播。Liu等人發現mcr-1能夠降低黏菌素的藥效[13]，對黏菌素產生耐藥性。mcr-1是磷酸乙醇胺轉移酶家族的成員，mcr-1蛋白通過5個跨膜螺旋(TMHS)錨定在細菌的細胞質膜的周質中;細菌的脂多糖在胞漿中被合成后，通過ABC轉運蛋白MSBA翻轉到內膜的外表面，然后進入周質中。由于mcr-1具有磷酸乙醇胺轉移酶的活性，脂多糖中的脂質A在周質中被磷酸乙醇胺共價修飾，二元調控系統(TCSs)被激活，使脂質A結構改變，導致細菌細胞外膜與多黏菌素的親和性下降，從而導致對多黏菌素耐藥性的產生。在mcr-1基因中，69%的基因結構中存在插入序列ISApl1，ISApll是一個高度活躍的元素，它的運動可能對宿主細胞有害[36]。這個可移動元件的整合會使mcr-1基因容易被其他質粒捕獲，從而實現mcr-1基因在不同菌種、不同地區之間傳播。研究表明，mcr-1陽性菌株不僅可以水平傳播，也存在克隆傳播，具有遺傳多樣性[37]。

4 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的檢測方法

4.1 blaNDM-1基因的檢測方法 由于產blaNDM-1細菌感染的臨床表現與敏感菌感染沒有差異，臨床診斷比較困難[38]，因此，blaNDM-1基因的檢測常常依賴于實驗室檢測。產blaNDM-1細菌的實驗室診斷包括篩查、表型確認以及分子確證實驗3個步驟。

4.1.1 表型篩查試驗 在細菌藥物敏感性測定中，以美洛培南或亞胺培南紙片法(K-B法)或者最低抑菌濃度(MIC)測定法對腸桿菌科細菌產酶情況進行初步篩查，如果達到以下標準，應懷疑細菌產碳青霉烯酶，需要進行表型確認。厄他培南特異性較低，不推薦用于篩查試驗。

4.1.1.1 K-B法 美洛培南(10μg紙片)抑菌圈直徑≤23 mm或亞胺培南(10μg紙片)抑菌圈直徑≤21 mm時，需要進行表型確認。

4.1.1.2 最低抑菌濃度(MIC) 測定美洛培南MIC≥0.5 mg/L時，需要進行表型確認;對大腸埃細菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬和腸桿菌屬，亞胺培南MIC≥2 mg/L時，可進行表型確認試驗。

4.1.2 表型確認試驗 采用亞胺培南＋EDTA復合紙片或者E紙條，進行KB法藥敏試驗或者MIC測定，如果復合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值≥5 mm，或單藥與復合制劑的MIC比值≥8時，判定產金屬β-內酰胺酶，需用分子生物學技術進行酶型確認。

4.1.3 酶型分子確認試驗 采用blaNDM-1的基因特異引物進行PCR擴增及產物測序，確認菌株是否攜帶blaNDM-1基因。

4.2 mcr-1基因的檢測方法 mcr-1基因的檢測方法有藥敏紙片擴散法(disk diff usion)、濃度梯度法(E-test)和自動化系統(auto mated systems)以及多黏菌素NP快速測試法(Rapid Polymyxin NP test)。研究表明，多粘菌素NP快速測試法對mcr-1基因的檢測效率更高，效果更好[39]。另外，Nor dmann P等人探測細菌細胞在多黏菌素存在時的葡萄糖代謝，來觀察其生長情況，進而鑒定其耐藥性[40]。Chabou S等人用Taq Man (R)探針進行快速實時PCR檢測，其特異性和靈敏度可達到100%[41]。

近年來，細菌耐藥問題已經向多重耐藥和廣譜耐藥方向發展，耐藥問題已成為人類重要的公共衛生問題，對人類、家畜家禽、環境等造成巨大的威脅。blaNDM-1基因和mcr-1基因的出現，尤其是其可水平轉移的特點，更新了人們的觀念，引起了全球的關注。目前，耐藥基因blaNDM-1和mcr-1還未形成嚴重的流行。因此，只要人們及時采取措施，合理有效的使用抗生素，就能嚴格控制耐藥基因的傳播，扭轉細菌耐藥問題的嚴重形勢。