關于建立子癇前期大鼠小鼠模型的研究進展

何岑盈謝瑩鶯*徐夢婷

(1.青海大學研究生院,西寧 810016; 2.青海大學附屬醫院婦產科,西寧 810001)

子癇前期(Preeclampsia,PE)在全球的發病率為2%～8%,每年可致大約70 000 孕產婦和500 000圍產兒死亡[1]。子癇是妊娠期高血壓疾病中最嚴重的形式,PE 是可以通過早期診斷、治療達到預防進展為子癇從而改善母體和圍產兒預后的一種疾病,由此可見PE 的動物模型對產科領域的研究十分重要。雖然嚙齒類動物中的大、小鼠胎盤結構比人類簡單且胎盤形成機制與人類不一致,但胎盤結構組成、細胞種類與人類相似,同時具備滋養細胞浸潤、子宮螺旋動脈重塑的特點[2],再加上大小鼠因經濟、易獲取、生存力強、妊娠周期短等特點受廣大研究者的青睞,故就PE 大、小鼠模型做一綜述。因PE 的發病機制尚未明確,大、小鼠PE 模型的制作和表型參差不齊,各有其優缺點,本文可為不同的研究目的選擇合適的方法制作模型提供參考依據,促進PE 的病理生理學和潛在治療措施研究的進步,從而有效的提高PE 孕產婦及圍生兒存活率。

1 子宮血流量減少模型

降低子宮血流量的手術方法有腹主動脈及雙側子宮血管卵巢支縮窄術[3]、腹主動脈分支雙側子宮動脈縮窄術[4]、在大鼠妊娠前進行腎主動脈縮窄術[5]等。這類動物模型具有很多PE 的表型特征:高血壓,蛋白尿,胎兒宮內生長受限,臍動脈血流S/D 值增高,光鏡和電鏡下的胎盤組織病理變化[4],典型腎組織病理改變[4],明顯心肌損傷[6]及胰島素敏感性降低[5]。該模型主要模擬了胎盤缺血導致PE發生的機制,在模擬血壓升高、氧化應激增強以及胎兒生長受限表型方面與人類最貼近,避免了用藥制作的模型藥物本身對實驗結果的影響,簡單易行,缺血部位明確,可以根據缺血部位的不同導致血壓、蛋白尿的不同變化[7],但系手術操作,需暴露子宮及胚胎,導致流產風險升高。在大鼠妊娠前進行腎主動脈縮窄術,可解決研究窗口窄的問題,觀察孕鼠整個妊娠期病理及生理變化,從而研究早期的免疫異常、滋養層細胞浸潤、血管改建等發病機制。但無HELLP 綜合征等嚴重的PE 并發癥。

2 炎癥免疫過度激活模型

Toll 樣受體9(toll-like receptor 9,TLR 9)是參與先天性免疫反應的關鍵模式識別受體[8],激活后可刺激Th1 淋巴細胞反應和釋放炎癥細胞因子[9]。He 等[10]研究發現于小鼠妊娠的第7.5、9.5 和11.5天給腹膜內注射TLR9 激動劑ODN1826(5 mg/kg),孕鼠可出現收縮壓升高,蛋白尿,腎小球內皮增生,脾腫大,胎兒生長受限和胎盤發育異常變化。未妊娠小鼠給予相同處理,未出現上述表型,即該模型是妊娠特異性的,且升高的血壓可在分娩后10 d 恢復正常。

白介素4(Interleukin-4,IL-4)是一種可以促進抗炎性Th2 淋巴細胞分化并抑制促炎性Th1 細胞分化的細胞因子。在 Chatterjee 等[11]研究中,IL-4 缺陷(基因敲除)C57BL/6J 小鼠妊娠后出現血清中促炎性細胞因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和白介素12(Interleukin-12,IL-12)水平升高,胎盤中的炎癥標志物細胞間黏附分子- 1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表達顯著增加,高血壓,主動脈松弛反應減低(內皮功能障礙),蛋白尿,脾重量/體重比增加,胎兒發育遲緩及死亡率增加。該方法同樣具有妊娠特異性。

抗AT1 受體自身抗體(autoantibodies against AT1 receptor,AT1-AAs)存在于PE 患者體內,可結合并激活血管緊張素II 受體1a 型(AT1 受體)[12]。通過將總IgG(大約800 μg 來自PE 妊娠婦女)或來自PE 患者的AT1-AAs 在眶內注射入妊娠第13 天的小鼠體內,可出現高血壓,蛋白尿,腎小球內皮細胞病,胎盤異常改變及胎兒生長受限[12]。該模型可以為PE 是一種自身免疫性疾病提供實驗支持。

3 血管內皮細胞損傷模型

3.1 炎癥介質模型

LIGHT(TNFSF14)是腫瘤壞死因子配體超家族成員[13]。向妊娠第 13～14 天的 C57/BL6 小鼠經眼球后靜脈叢注入藥物LIGHT(用生理鹽水稀釋,濃度為2 ng/100 μL,劑量為2 ng/d),孕鼠出現了明顯的高血壓,蛋白尿,胎盤和腎組織輕微病理損傷,胎兒宮內生長發育遲緩,循環中可溶性FMS 樣酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)、內皮素-1(Endothelin-1,ET-1)均升高,但血壓及ET-1 在非妊娠小鼠中也可見升高[14],無妊娠特異性。自妊娠第13 天開始,通過皮下植入微型滲透泵,持續釋放腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α),劑量設置為 500 ng/(kg·d),直到分娩,C57BL/6JARC 小鼠出現高血壓,蛋白尿,炎癥反應分子/天然免疫系統分子 Toll 樣受體3(toll-like receptor 3,TLR-3)、Toll 樣受體 4(toll-likereceptor 4,TLR-4)在胎盤迷路母細胞間隙的滋養細胞膜和蛻膜細胞中表達上調,以及缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)在胎盤組織中表達上調[15]。該模型表明腫瘤壞死因子失衡引起的Toll 樣受體(toll-like receptor,TLR)和HIF-1α 調節失調可能參與了PE 的發病機制。

內毒素的毒性成分主要為類脂質A,作用于機體可引起炎癥反應。王志堅等[16]對妊娠第15 天的Wistar 大鼠沿尾靜脈緩慢注入內毒素(1.0 μg/kg),發現動物出現高血壓,蛋白尿,腎功能損害,胎兒生長受限及死胎率升高。后其他研究者發現該方法引起的胎盤慢性炎癥表現包括:迷路帶纖維蛋白沉積、組織核碎裂,基帶炎性細胞浸潤,蛻膜帶腫脹增厚等,這些病理變化與人類PE 胎盤表現類似[17]。未見腎病理報道。相關試驗過程中未發生尾靜脈炎,可考慮PE 是內毒素引起的廣泛炎癥導致。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的組成成分之一是脂質A(或內毒素)的疏水域[18]。從妊娠的第13 天開始至第18 天每天一次給SD 大鼠腹膜內注射LPS,研究表明從20 μg/kg 劑量開始每天增加10 μg/kg 是最合適的用LPS 建立PE 動物模型的劑量選擇,可保持相對較高的胎兒存活率,導致母體血清和胎盤炎性細胞因子升高,胎盤明顯的炎癥病理變化,高血壓,蛋白尿,胎兒生長受限及早產[19]。據文獻報道LPS 造模對母體無明顯影響[20]。未見腎病理報道。

合體滋養細胞微絨毛膜(syncytiotrophoblast microvillous membrane,STBM)是合體滋養細胞凋亡時,合體滋養細胞微絨毛從細胞表面脫落下來進入到母體循環中形成的囊泡樣顆粒[21],其可以導致小血管內皮細胞的功能紊亂[22]。研究者直接采用PE孕婦分娩的胎盤制備STBM,于SD 大鼠妊娠的第7.5 天、第10.5 天、第13.5 天通過尾靜脈注入生理鹽水量+含STBM 液體量分別為0.3 mL+0.3 mL、0.3 mL+0.3 mL、0.4 mL+0.4 mL,孕鼠出現了高血壓,蛋白尿,肝腎功能損害,血漿中炎癥因子TNF-α、IL-6 升高,胎兒發育遲緩,血小板減少及腎組織病理損害[23],但未見胎盤病理報道。

3.2 一氧化氮合成酶缺乏模型

亞硝基左旋精氨酸甲酯(N-nitro-arginine methyl ester,L-NAME)是一種一氧化氮合成酶抑制劑[24]。過量sFlt-1 表達可誘導一氧化氮合成酶缺乏[25]。有研究表明將Wistar 大鼠在妊娠2 周后連續5 d 注射劑量為200 mg/(kg·d)的L-NAME,可建立 PE 模型。該模型的Th1/Th2 發生Th1 方向偏移,可模擬PE 免疫抗炎作用失衡的發病機制[26]。Feng 等[27]于妊娠第0 天開始用L-NAME,劑量為80 mg/(kg·d),給 SD 大鼠灌胃8 d,也成功建立了 PE 模型。Shu 等[28]通過實驗得出 SD 大鼠從妊娠第9 天開始,連續皮下注射L-NAME,用量為75 mg/(kg·d),建立的模型是一種最符合人類PE 表型的模型。根據以上文獻及其他相關報道可知,孕鼠注射LNAME 可產生與人類PE 類似的表型[29],涵蓋了高血壓,蛋白尿,腎功能損傷,腎小球內皮病等典型腎病理,肝功能損傷并伴有肝小葉周邊區域局灶性壞死的肝病理,胎盤炎性細胞浸潤、纖維素樣壞死及出血性梗死的胎盤病理,自然流產死胎,胎兒發育受限,仔鼠畸形[29],母鼠腎上腺功能受損,胎鼠腦組織神經細胞損傷及腎上腺、胰腺功能損傷等對后代產生的各種影響[30]。sFlt-1 具有抗血管生成特性,通過在妊娠第8 天或第9 天給大鼠尾靜脈注射編碼鼠源sFlt1 基因產物的重組腺病毒,報道了明顯的高血壓,嚴重的蛋白尿,腎小球內皮細胞增生,無妊娠特異性。有趣的是,給予抑制sFlt-1 表達的對照組妊娠小鼠未發生PE,未妊娠小鼠卻出現了PE 表型。sFlt1 在胎盤滋養細胞分化和發育中的作用還有待繼續探索[31]。

4 血液高凝模型

Omatsu 等[32]向ICR 妊娠小鼠體內注入能提供凝血因子酶促反應表面的磷脂酰絲氨酸/磷脂酰膽堿(PS/PC)微團,孕鼠可出現血壓增高、蛋白尿、胎盤絨毛間隙廣泛纖維蛋白沉積等,但血壓升高未達到140 mmHg。張焱等[33]隨后復制并優化了該模型,ICR 小鼠自妊娠第5.5 天開始經尾靜脈給予0.1 mL PS/PC(1 mg/d)至妊娠第16.5 天,上述表型均出現,還可見宮內胎兒生長遲緩、死胎,其中死胎率為2.10%,高血壓超過140 mmHg。PE 模型的仔鼠總體表現為勻稱性胎兒生長受限與臨床PE 類似,伴腦發育障礙[34]。該模型適合從凝血功能和胎盤病理方面研究PE 發病機制[33]。

5 基因修飾模型

5.1 基因敲除模型

APOE 是一個多功能蛋白,在包裝和轉運脂類中起主要作用。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是一氧化氮合酶(NOS)中的一種類型,激活后能在短時間內產生大量的NO[35]。APOE-/-純合子小鼠于妊娠第12 ～16 天出現血壓升高,尿蛋白增加,胎兒宮內生長受限,明顯的血脂異常,胎盤病理變化,胎盤組織炎癥相關蛋白 TNF-a、IL-6、NF-κB 表達水平明顯升高,但血壓未超過 140 mmHg[35]。APOE-/-iNOS-/-雙基因敲除小鼠可使PE 癥狀較APOE-/-單基因敲除組加重,血壓可超過140 mmHg,血清及胎盤中 NO 明顯減少[35]。兒茶酚氧位甲基轉移酶(COMT)是一種在人體內廣泛存在的細胞內酶,主要作用是通過使雌激素及兒茶酚胺類物質降解而避免心血管疾病發生。有研究發現COMT 基因缺失的孕鼠可出現高血壓,蛋白尿,腎小球血管內皮病變,類似人類胎盤的蛻膜血管病變,血漿中sFlt1 濃度及胎盤中HIF -1α 蛋白表達明顯升高[36]。以上基因敲除模型可讓研究人員從先天遺傳學及內分泌代謝異常的角度探討PE 發病機制。

5.2 H19X siRNA 模型

H19X包括H19基因和非編碼 RNA(non-coding RNA,lncRNA),在胎盤中特異性表達,與胎盤形成及胚胎生長、發育密切相關[37]。大量證據表明,lncRNA 可以被小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默[38]。給 C57BL/6 孕鼠注射含H19XsiRNA 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修飾的聚乙二醇化陽離子脂質體(arginine-glycine-aspartic acid peptide modified PEGylated cationic liposome,RGDLip),H19XsiRNA 被有效轉移到胎盤中,孕鼠可出現血壓升高,尿蛋白/肌酐比率顯著增加,胎盤血管密度及分支減少,典型腎病理變化,明顯的胎兒體重減輕和胎兒吸收[39]。該模型優點為無需手術即可敲除H19X導致小鼠出現PE 樣癥狀,RGD-Lip 載體的毒性和H19XsiRNA 誘導的炎癥可以忽略,但H19X和PE 之間的確切關系有待進一步研究證實。

6 內分泌代謝異常模型

6.1 鹽皮質激素模型

醋酸去氧皮質酮(desoxycorticosterone acetate,DOCA)是鹽皮質激素,有類醛固酮作用,可使細胞外液容積增加。陳雅[40]將SD 大鼠整個孕期予以0.9%生理鹽水(NS)喂養,然后于妊娠第1 天、第8 天、第 15 天經腹腔分別給予 DOCA 12.5 mg、DOCA 6.5 mg、DOCA 6.5 mg,出現了平均動脈壓升高,蛋白尿,心率升高,腎交感放電活動(renal sympathetic nerve activity,RSNA)增強。隨后有研究者繼續復制該模型,證實該模型的平均動脈壓、血流的流速和尿蛋白濃度的變化與PE 患者一致,尿液中去甲腎上腺素排出量增加,腦干交感中樞頭端延髓腹外側區(rostral ventrolateral medulla,RVLM)中的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平明顯升高和氧化應激相關蛋白NADPH氧化酶亞型(NOX4)表達上調,對照組微量注射超氧化物歧化酶(SOD)模擬物Tempol(5 nmol)可導致PE 大鼠的血壓,心率和RSNA 顯著降低,表明RVLM 中氧化應激過度激活與交感神經過度活躍及高血壓有關,為PE 發病機制的研究提供了一種新的思路[41]。

6.2 雄激素模型

Chinnathambi 等[42]于 SD 大鼠妊娠的第 15 ～19天給予皮下注射丙酸睪丸激素,用量0.5 mg/(kg·d),可模擬人類PE 因睪丸激素水平導致的平均動脈壓升高。其他研究結果還表明,妊娠期間孕鼠睪丸激素水平升高會導致腎肥大和蛋白尿[43],子宮動脈的NO 介導的血管舒張作用減低[44],胎盤的大小、體重減低及氨基酸向胎鼠的轉運減少但不改變葡萄糖轉運[45-46],胎盤氧合減低及胎兒缺氧[47]。有文獻表明在PE 中觀察到的某些血管和胎盤病變可能是睪丸激素介導的[43]。

6.3 腺苷脫氨酶缺乏模型

在Iriyama 等[48]的實驗中,通過引入在α-甲胎蛋白調控下,才能僅在胎兒肝中表達的ADA 小基因(fLi-Tg)來產生胎兒肝拯救的腺苷脫氨酶缺陷鼠( fetal liver rescued adenosine deaminase-deficient mice,Ada-/-/fLi-Tg+ mice),研究者通過Ada-/-/fLi-Tg+ mice 模型評估了整個妊娠期間胎盤腺苷升高的影響。他們設計了一種交配策略,即將雄性Ada-/-/fLi-Tg+ mice 與雌性Ada+/-/fLi-Tg+ mice 雜交,獲得一半胎盤被認為是ADA 缺陷且腺苷水平升高的懷孕小鼠,發現該模型從胚胎形成的第15.5 天(E15.5)開始表現出平均收縮壓持續升高,到產后第5 天恢復正常,在E18.5 尿蛋白顯著升高到產后第7 天恢復至未孕狀態,胎兒生長受限,胎盤重量減輕、血管系統受損和循環中Flt1(fms-like tyrosine kinase-1)基因表達增加,典型腎病理變化。因為胎盤腺苷升高發生于胎盤脈管系統受損、胎兒生長受限及母體PE 特征之前,考慮胎盤腺苷升高可能是上述變化的基礎,可以推動PE 進展。

7 低氧模型

HIF-1α 在早孕胎盤低氧環境中高表達,在胎盤發育中起著重要作用[49]。通過給妊娠第8 天的C57BL / 6 J 孕鼠尾靜脈注射穩定表達HIF-1α 的腺病毒,孕鼠可出現顯著高血壓,蛋白尿明顯增多,胎兒宮內生長受限,胎盤及腎組織病理損害,HELLP樣綜合征以及肺組織的彌漫性炎癥、血管損傷和出血[50]。Albers 等[51]補充了該模型的PE 表型調整,包括典型腎病理變化,胎盤血管分支形態減少和螺旋動脈重塑失敗,以及妊娠期高血壓在分娩后可恢復正常。Lai 等[52]建立了另一種低氧模型,通過將C57BL/6 小鼠(野生型或IL-10-/-)在妊娠的第7.5～17 天暴露于低氧(9.5%)環境中均可引起孕鼠出現高血壓,蛋白尿,腎病理損害,胎兒宮內生長受限。HIF-1α 的腺病毒產生的HELLP 樣綜合征在妊娠及非妊娠鼠中均存在,考慮HELLP 綜合征與高血壓和腎損害發展之間對于胎盤需求的差異可能在于不同的致病機制[50]。用IL-10 基因敲除小鼠或野生型小鼠在低氧環境中建立的模型均為妊娠特異性,IL-10 的缺乏可進一步加重上述PE 癥狀及病理變化。該模型可以為研究IL-10 與低氧之間的相互作用及對PE 的影響提供研究基礎。

8 自發性高血壓并發PE 模型

Dahl 鹽敏感性大鼠和BPH/5 小鼠都是自發性高血壓的遺傳模型動物[53-54]。SHRSP 大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat) 是腦卒中易發性高血壓癥模型動物[55],妊娠后存在異常子宮動脈重構病變[56]。Dahl 鹽敏感性大鼠在妊娠晚期出現的變化包括血壓較前升高,蛋白尿,胎盤組織及腎組織病理損害,胎兒生長受限,胎盤中HIF-1α 和 TNF-α 表達升高,血漿中 TNF-α、sFlt-1 濃度升高[53]。BPH/5 小鼠懷孕期間觀察到的表型與Dahl 鹽敏感性大鼠的PE 表型相似[53]。用微型泵給SHRSP 大鼠于妊娠的第10.5 天起至足月止持續輸注血管緊張素Ⅱ(angiotensin II,AngⅡ)500 ng/(kg·min)或 1000 ng/(kg·min),妊娠期間出現血壓顯著升高,蛋白尿,心輸出量降低,子宮動脈直徑減小,子宮動脈僵硬度增加,胎兒生長受限等PE 表型[56]。Dahl 鹽敏感性大鼠和BPH/5 小鼠可為心血管疾病合并PE 的遺傳方面的研究提供造模對象,而SHRSP 大鼠適用于后天獲得性與心血管疾病相關的PE 研究。

9 小結及展望

目前雖有手術、生物制劑誘導、基因敲除、物理治療等方法建立PE 模型,但國內仍以生物制劑誘導造模的應用更為廣泛,該方法易操作,過程簡單,成功率高。本文章綜述的造模機制之間具有相關性,尤其在炎癥免疫過度激活與血管內皮損傷模型中,一系列的炎癥反應可以引起血管內皮損傷,反之亦然,這也很好地證實了PE 發病是多因素相互作用的結果。不同的方法都可以成功建立PE 模型也可為PE 的發病機制及預防治療提供多種可能性,因造模方式中的生物制劑或基因相關信號過程與PE 發病相關,可考慮通過其激動(或阻斷)劑,以及對相關信號過程的修飾來減輕PE 癥狀從而提高妊娠安全性。國內也有少量將兩種造模方法組合而成功建立PE 模型的研究報道,一種PE 模型的表型有限,將兩種或者更多方法組合起來則有望研究出更完善的PE 模型。另外,在胎盤植入過程中,大鼠的滋養層浸潤比小鼠模仿人的胎盤更好[57],因此可能更適用于PE 造模?？偠灾?PE 的發生發展是一個復雜的過程,目前沒有一種動物模型能完全復制疾病的自然進程,每種造模方法都有其自身的優勢和局限性,實驗者應根據自己的研究方向和實驗需求選擇合適的PE 模型,從而推進人類攻克PE這類疾病的歷史進程。