檢測ONOO-類的近紅外熒光探針

黃麗娜（云南師范大學，云南 昆明 650500）

過氧亞硝酸鹽（ONOO-）是生命系統中內源性產生的活性氧（ROS）之一，它是通過超氧自由基（O2·-）和一氧化氮（NO）在體內偶聯反應生成的[1]。由于ONOO-是強的生物氧化劑，因此反應活性很高，表現出不穩定性，但是它在信號轉導中起著至關重要的作用，并且還表現出抗菌和抗菌活性[2]。ONOO-在生物體內的含量過高或過低都會導致許多疾病，比如癌癥、心血管疾病、神經退行性疾病、炎癥等[3]。另外，ONOO-會引起許多細胞受損，包括DNA 和蛋白質[4]。因此，開發具有高選擇性、高靈敏度，生物相容性好以及能夠特異性識別的方法來檢測ONOO-至關重要。然而，由于ONOO-也存在一些缺陷，如半衰期短（＜10ms），活性高，濃度低、在體內難于被捕捉等[5]。所以，檢測生物體內ONOO-也成為了巨大的挑戰。盡管已經使用了許多方法來檢測ONOO-，但是具有熒光探針的熒光成像技術由于易于操作，高靈敏度和選擇性以及原位檢測而受到越來越多的關注[6，7]。

目前，盡管已經有許多方法ONOO-進行檢測，但是卻存在著許多缺陷，而熒光成像技術具高靈敏度、高選擇性、操作簡單及原位實時檢測等優點。近紅外熒光探針分子由于具有高度共軛多烯的結構，具有近紅外吸收和發射光譜、低背景熒光，組織穿透力強、抗干擾能力強，對細胞損傷小。另外，近紅外熒光探針主要是基于優異的熒光團（如菁染料、半菁染料、苯并吡喃腈、香豆素、羅丹明、氟硼吡咯等）來檢測ONOO-。

1 近紅外熒光分子探針用于檢測ONOO-

2013年，Han課題組基于氟硼吡咯熒光團設計合成了一個基于分子內電荷轉移（ICT）的比率熒光探針[8]。當加入ONOO-后，探針在680nm 處逐漸增強，而在572nm 處的逐漸減弱，表現出了比色變化。該探針具有優異的選擇性、高的靈敏度和抗干擾性，檢測限低至5μM。因此，該探針被應用于RAW264.7細胞中的ONOO-的檢測。

2014 年，James 課題組報道了一種檢測內源性ONOO-的熒光探針[9]。該探針是基于萘酰亞胺熒光團和硼酸鹽設計的。在單糖（例如D-果糖）存在下，熒光信號增強，而在過氧亞硝酸鹽的存在下，與D-果糖結合時探針的熒光被關閉，并且ONOO-顯示了較高的選擇性。更重要的是，該探針已經成功用于在RAW264.7和HeLa細胞中內源性及外源性ONOO-的檢測。

2016 年，Qian 課題組設計合成了一個基于FRET 的小分子比率熒光探針[10]。該探針由Cy3 和Cy5 兩種菁染料組成，用于檢測ONOO-。以530nm 為激發波長，探針滿足Cy3 的FRET 機理，在660nm處顯示Cy5的熒光。當加入ONOO-后，在560nm處顯示熒光增加，在660nm 處的熒光減弱，這是由于ONOO-選擇性氧化了Cy5熒光團。該探針具有很好的選擇性和高靈敏度，可定量檢測活細胞中的ONOO-。

2017 年，Ma 課題組設計合成了一種以羅丹明為熒光團的熒光探針用于檢測ONOO-[11]。該探針是通過對羅丹明結構進行修飾，通過連接三苯基膦和苯肼來構建，探針本身幾乎沒有熒光，當加入ONOO-后，在波長550nm 顯示強烈的吸收，同時，溶液的顏色由無色變為粉紅色。以550nm為激發波長，探針在578nm顯示最大的發射峰，并且熒光增強近80倍。這是由于苯肼被ONOO-氧化，將羅丹明熒光團釋放出來。探針的檢測限為55nM，且選擇性高于其他ROS。更重要的是，該探針不僅可以廣泛應用于檢測線粒體的中ONOO-還可以用于與ONOO-相關疾病的診斷。

2018 年，Tang 課題組設計合成了一個用于檢測線粒體中ONOO-的雙光子近紅外熒光探針[12]。該探針以香豆素衍生物作為熒光團與對硝基苯基碳酸酯作為供體連接。在探針溶液中加入ONOO-后，氨基被還原，此時發生PET過程，熒光恢復。從光譜可以看出，探針在570nm處有最大吸收，630nm處出現最大熒光發射，并且具有較高的熒光量子產率。該探針能夠特異性識別、具備高靈敏度和能夠快速響應ONOO-的性質，并且這些特性表面了探針能夠在心肌細胞和心臟組織中監測線粒體ONOO-的濃度變化并對其進行成像。

2018年，Yoon課題組設計合成了一個雙光子熒光探針用于監測細胞和組織中的ONOO-[13]。該探針是以NMDA 受體抑制劑和拮抗劑作為靶向NMDA受體的一部分，硼酸作為反應位點監測來ONOO-。該探針檢測ONOO-的水溶性較好，在最短時間內能夠快速響應，表現出較高的選擇性和靈敏度，成為研究與神經系統中ONOO-相關疾病的有用的成像工具。

2019年，Feng課題組設計合成了一種用于檢測生命系統中外源性和內源性ONOO-的可靶向溶酶體的熒光探針[14]。該探針能夠快速響應（25μs）、高靈敏度（檢測限為16nM）、高的選擇性和低毒性。更重要的是，該探針可靶向溶酶體，用于對活細胞中的溶酶體ONOO-成像。

2019 年，Liu 課題組基于苯并吡喃腈熒光團設計合成了一種用于特異性檢測ONOO-的熒光探針[15]。探針在470nm 處有最大吸收峰，在630nm 處出現最大發射峰，同時具有較大的斯托克斯位移（160nm）。當加入ONOO-后，探針中的酰胺鍵斷裂，分子內電荷轉移（ICT）和光誘導電子轉移（PET）過程增強，苯并吡喃腈的熒光被恢復。此外，該探針具有較好的生物相容性和選擇性，因此，可用于檢測內源性ONOO-濃度并在巨噬細胞中進行成像。

2 結語

近紅外熒光探針由于具有深層的組織穿透能力和對細胞損傷小的優點，尤其是還可以檢測生物體內的活性氮和活性氧。為此，已經越來越受到人們的關注。這篇文章基于優異的熒光團設計合成了低檢測限、高靈敏度和高選擇性的用于檢測ONOO-的近紅外熒光探針，所設計的這些探針已成功應用于活細胞和組織中。另外，近紅外熒光探針成像技術已逐漸應用到了醫學領域，成為今后開發用于體內和體外檢測活性氮和活性氧的熒光探針的有利的工具。