常用哮喘動物模型的建立

李泳興，鐘 鳴，王 勇，馬武華

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科，廣州 510405)

哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應和氣道重塑為主要特征的慢性呼吸系統疾病。已有大量研究證明了各種動物模型可以反映人類哮喘反應的各個具體方面。一個理想的動物模型應該盡量能體現人類哮喘病理生理的主要方面，包括IgE介導的抗原敏感性、急性支氣管收縮、氣道阻力增加、氣道慢性炎癥、輔助型T細胞2(T helper 2 cell，Th2)細胞因子產生、嗜酸性粒細胞增多、晚期氣道阻塞、粘液分泌增強、粘液纖毛清除率降低、氣道壁重塑與平滑肌增生[1-2]。哮喘動物模型的建立是研究哮喘發病機制和發展的基礎。不同動物哮喘模型種類繁多，研究方法也多種多樣。哮喘動物模型是了解疾病病理生理學和測試潛在藥物治療的實用工具。當選擇了合適的動物種類和疾病的誘導方法時，這些模型的結果可以應用于哮喘患者。本文綜述了建立哮喘動物模型時不同動物的特點、使用的試劑及造模時間的研究進展，以期幫助研究者根據研究設計選用合適的動物、試劑和合適的實驗周期。

1 常用哮喘動物模型的特點

哮喘主要是一種人類疾病，動物中只有貓和馬才能自發地產生類似的疾病[3]。大約只有1%的貓和特定喂養下的馬能產生類似于過敏性哮喘的過敏性氣道反應，但在實驗室環境中很難復制出理想動物哮喘模型，而且這兩種動物模型不容易用于探索疾病機制或測試新療法。鑒于自發性哮喘動物模型的限制，因此實驗室常用造模方法主要采取特定試劑誘導產生人類哮喘模型，常用動物哮喘模型主要包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，狗、羊和靈長類動物由于價格昂貴等原因較為少用。

1.1 小鼠

小鼠由于其遺傳背景明確、品系多、價格便宜以及容易誘發出氣道高反應性，產生氣道炎癥以及黏液增多等癥狀。因此是最常使用的哮喘模型。常用品系包括BALB/c、C57BL/6和KM小鼠[4-5]等。其中由于BALB/c小鼠比其他小鼠造模成功率高而最常使用[6-8]，但近年來由于基因敲除技術的發展，C57BL/6敲基因小鼠也越來越多地用于哮喘相關研究[9-10]。目前普遍采用的標準模型是由卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘發。OVA誘發的小鼠模型完全由Th2型嗜酸性粒細胞驅動，并主要為Th2高表達[3]。小鼠的氣道和肺與人類有許多解剖和生理上的差異。小鼠的遠端氣道是非肺泡化支氣管，而在人類中它是呼吸性支氣管。此外，細胞的類型和位置可能有所不同。例如，基底細胞存在于人的氣管支氣管內，但僅存在于小鼠的氣管中。另外小鼠氣道平滑肌明顯較少，對影響支氣管張力的藥物不易作出反應。小鼠模型的一個主要缺點是在致敏后缺乏對過敏原的慢性反應，在建立慢性哮喘模型時成功率較低。

1.2 大鼠

大鼠也是實驗室常用的哮喘模型[11]。它們相對便宜，與小鼠相似，具有來源廣，價格低廉，易繁殖和飼養等特點，因此大鼠也是一種常用的哮喘動物模型。麻醉后的大鼠由于其體積大和穩定性高，有利于在吸入過敏原發生急性哮喘后各種生理指標的測量[12]。另外，因其體積大，麻醉后操作或取材等相對容易，而且實驗中各項指標的檢測相對誤差小。因此，大鼠模型在支氣管哮喘和其他肺部疾病的研究中仍具有重要作用。在新藥的藥物研究中，大鼠模型仍然是必不可少的。與其他物種相比，大鼠具有特有的支氣管循環的解剖學特征，以及在遺傳學、蛋白質組學、肺功能及價格等方面它具有更多優勢[13]。目前常用品系大多選擇SD、 Wistar或Brown-Norway大鼠作為實驗對象[14-15]。

1.3 豚鼠

豚鼠是最古老的過敏性氣道高反應動物模型之一。豚鼠容易被致敏，發生哮喘的生理、氣道解剖和對炎癥介質的反應等與人類更相似，可產生IgE依賴性的哮喘模型[16]，因此是最早選用的哮喘動物模型。與嚙齒動物哮喘模型相比，豚鼠對OVA較敏感，并且很容易產生類似哮喘癥狀和氣道阻力增加反應。豚鼠非常適合用作研究化學刺激因子過敏反應的模型。豚鼠也經常用作藥物治療的篩選模型，可用于開發β受體激動劑和皮質類固醇等藥物[12]。

1.4 家兔

家兔是研究哮喘肺生理和病理生理的有效模型。與老鼠等較小的物種相比，其獨特的優勢在于家兔可用于自身對照來研究慢性哮喘。此外，家兔從出生到成年都表現出對過敏原的敏感性，為研究過敏性疾病的危險因素提供了條件。由于兔模型與人類哮喘的相似性，因此為研究新型哮喘治療藥物的療效提供了理想的依據[1]。

2 常用哮喘動物的造模時間

2.1 BALB/c小鼠

BALB/c小鼠哮喘造模時間多種多樣，最常使用的是23 d OVA造模法[17]，5～6周齡大的小鼠，以混合1% 氫氧化鋁(Al(OH)3)的OVA第1天和第14天腹腔注射誘發致敏。在第21、22和23天，以1 mg/mL濃度的OVA的滴鼻激發。高琴琴等[18]采用第1、8、15天腹腔注射致敏，第22～28天霧化激發的方法對BALB/c小鼠造模，總用時28 d，也可成功造模。Debeuf等[19]采用OVA+AL(OH)316 d造模法，第1天和第7天腹腔注射OVA致敏，第14～16天吸入1%的OVA激發，總用時短，肺組織切片和氣道阻力等檢測顯示也可成功造模。

同時，Debeuf等[19]也采用屋塵螨(house dust mite，HDM)14 d造模法，第1天在BALB/c小鼠氣管內吸入1 μg的HDM致敏,第6～10天鼻腔滴注10 μg HDM溶液激發，第14天處死小鼠取材，此方法用時最短。或者小鼠在第1、3和5天每天接受30 μL的HDM致敏，在第12、13和14天接受激發，也可成功造模。

Bao等[20]使用HDM總共41 d制作哮喘復發模型，在第0、7和14天，雄性BALB/c小鼠腹腔注射50 mg HDM(0.5 mg/mL)致敏，第21～23天經鼻腔滴入25 mg HDM(2.5 mg/mL)激發，并在在第38～40天滴入25 mg HDM(2.5 mg/mL)進行再次激發，即哮喘復發模型。

2.2 C57BL/6小鼠

C57BL/6小鼠哮喘模型制作時間與BALB/c小鼠差別不大，但造模試劑稍有不同，除了OVA以外[9]，直徑小于2.5 μm的細顆粒物(particulate matter ≤2.5 μm，PM2.5)和蟑螂過敏原等也常用于哮喘的造模。Zheng等[21]在第0天和第14天腹腔注射0.2 mL 0.4% OVA致敏，然后在第17天和第20天吸入PM2.5(3 mg/mL)再次致敏，在第21天～28天進行霧化吸入2%的OVA溶液激發。Li等[5]聯合使用蟑螂過敏原和PM2.5，可以把造模時間縮短到14 d。

2.3 大鼠

Dong等[22]使用Wistar大鼠21 d造模方法，在第0、7和14天用1 mg OVA+20 mg Al(OH)3腹腔注射致敏。第21天氣管內滴注1.1% OVA于200 μL生理鹽水激發，即可成功造模。

2.4 豚鼠

豚鼠可建立急性和慢性哮喘模型，急性哮喘模型建立總天數為15 d，慢性模型建立總天數為29 d。豚鼠先在第1天和第5天腹腔注射OVA+Al(OH)3致敏，然后急性哮喘模型在第15天吸入1 h 0.01% OVA激發，慢性哮喘模型在第17～29天每隔48 h先腹腔注射mepyramine 30 mg/kg 然后吸入0.1% OVA，均可成功建立哮喘模型[23]。

2.5 家兔

家兔常用于造慢性哮喘模型，在新生兔出生后24 h內，將可溶性牛血清白蛋白(BSA)與小棒狀桿菌佐劑一起注射給新生兔。接下來的兩周每周注射一次，接下來的兩個月每兩周注射一次，總共造模時間為兩個月[1]。

3 造模試劑

3.1 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)

最常使用的過敏原為卵清蛋白，來源于蛋清，價格便宜，有很強的免疫原性，是一種良好的過敏原[24-25]。國內外研究的致敏劑量多選用20、50、100 μg濃度的 OVA 進行致敏[7,26]。楊素明、高琴琴等[4,18]研究認為劑量為50 μg/mL 時效果最佳。三種劑量 OVA 誘發的哮喘模型均獲成功,但綜合而言 50 μg OVA 所誘發的BALB/c 小鼠哮喘模型血清IgE、IL-4、IFN-γ含量以及肺組織病理改變更為明顯。OVA不僅對造模小鼠產生影響，還可對致敏后的小鼠下一代產生持續影響[27]。

OVA常與AL(OH)3聯合用于小鼠哮喘造模[28]，AL(OH)3作為佐劑能夠提高免疫系統抗原特異性Th2的免疫應答反應。因此急性哮喘致敏時通常需要多次給予加入佐劑的過敏原。AL(OH)3是動物接觸抗原后產生Th2免疫反應的最佳選擇之一[12]。

3.2 屋塵螨(house dust mite，HDM)

HDM是一種與人類相關的無處不在的過敏原，是人類和動物過敏性哮喘的最常見誘因之一[29-30]。HDM代謝產生的蛋白質，如粉塵螨蛋白酶(Derf)1起到過敏原的作用。此外，HDM含有內毒素的革蘭氏陰性細菌，在自然腸道菌群中內毒素會引起強烈的炎癥反應，被認為是一種佐劑[31]。黃超文等[32]研究發現HDM和OVA 所誘導的哮喘小鼠產生的氣道炎癥以及肺泡灌洗液中以嗜酸性粒細胞為主，氣道平滑肌增生明顯，Th2炎癥因子表達增高。

3.3 血小板活性因子(platelet activating factor，PAF)

血小板活性因子(PAF)是一種脂質介體，參與多種過敏反應。它從多種免疫細胞(如嗜酸性粒細胞，嗜中性粒細胞和肥大細胞)釋放，并且在特異性結合其受體后也對大多數細胞產生作用，成為多效介體。在炎癥介質中只有PAF可引起氣道高反應。PAF由于其獨有的特性，在激發豚鼠哮喘發作時可直接激發出氣道高反應而不需要致敏過程，它可引發支氣管收縮、嗜酸性粒細胞和分泌物增加以及氣道微血管滲漏等變化[33]。

3.4 交鏈孢霉

交鏈孢霉是真菌來源的過敏原，它在真菌類的過敏原中比例最高，它由于破壞氣道上皮屏障功能而使哮喘患者的病情加重。在動物實驗中，交鏈孢霉可引起小鼠氣道阻力增加、順應性降低、血清總IGE水平明顯升高、BALF中IL-4水平明顯升高以及IFN-γ水平明顯下降[34]。

3.5 臭氧O3

臭氧(O3)可用于哮喘小鼠激發過程中，雌性BALB/c小鼠在第23、25和27天OVA激發30 min后再暴露于1.0 ppm O33 h。OVA激發過程中的O3暴露促進了哮喘的惡化。p38 MAPK和氧化應激在臭氧加劇哮喘過程中起著關鍵作用，同時抑制這兩條途徑可顯著降低O3對哮喘發作的不利影響[35]。

3.6 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)

呼吸道病毒感染與哮喘惡化密切相關。但是大多數人類呼吸道病毒不是小鼠的天然病原體，因此需要大劑量地接種，但RSV導致的小鼠模型在病理學、免疫學和疫苗生物學等機制研究中有其獨特的優勢[36]。

在過敏性哮喘中，RSV作為引發感染的誘因，暴露于高水平的致敏過敏原可能會導致病情惡化。慢性哮喘模型中，接種大劑量的呼吸道合胞病毒確實會引起過度的炎癥反應，并增強中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的聚集[37]。李海霞等[38]研究發現RSA聯合OVA可誘發幼年大鼠哮喘發生，肺泡灌洗液中白細胞計數明顯升高，以嗜酸性粒細胞為主，肺組織病理顯示支氣管結構紊亂，支氣管壁增厚，炎性細胞浸潤。袁麗粉等[39]通過OVA致敏并予以RSV激發建立哮喘小鼠模型研究發現：與單獨OVA激發相比，加入RSV后在動物模型中的病理過程與患者更相似、氣道炎癥及氣道高反應更為明顯、病理切片中肺組織損傷加重，而且造模成功率高，方法簡單容易操作。

3.7 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)

在哮喘模型中，小鼠經LPS致敏后，肺組織中內質網應激標志物的表達水平顯著增加[40]。Liu等[11]通過腹腔注射LPS和吸入OVA激發建立哮喘大鼠模型。LPS常與OVA聯用作為哮喘造模的致敏或激發，可提高造模成功率。

3.8 直徑小于2.5 μm的細顆粒物(particulate matter ≤2.5 μm，PM2.5)

近年來，越來越多文獻常用PM2.5對C57BL/6小鼠進行造模，PM2.5可通過抑制調節性T細胞(Regulatory T cells,Treg)的分化和促進輔助型T細胞17(T helper 17 cell，Th17)的分化從而干擾Th17/Treg的平衡加重小鼠的哮喘[5]。另外，PM2.5還可導致小鼠肺嗜酸性粒細胞增多，加重過敏性哮喘和炎癥性肺病[21]。

4 結語

哮喘動物模型可以為哮喘的發病機制和治療提供有價值的信息，建立合適哮喘動物模型是了解哮喘病理生理學和試驗新療法的必要前提。在設計哮喘動物模型時，重要的是要了解各種哮喘動物模型的特點、造模方法和獨特表現，以及了解所選動物模型哪些方面的肺組織結構或功能與人類哮喘相似。開發一個具有代表性的模型必須考慮到動物生物學知識、哮喘的誘導方法、模型評估的結果是否與人類哮喘特征相對應等。然而，到目前為止還沒有一個理想的模型能夠代表人類哮喘這種復雜疾病的所有特征。因此，本綜述提供了目前用來制作哮喘模型的常用動物的特點、不同的造模方法及所選試劑以及造模所需的時間，有助于研究者根據研究設計選擇合適的動物、方法和試劑，更有助于實驗的順利開展。