類器官模型在前列腺癌異質性研究中的應用

周麗桂，張永斌，師長宏

(1.廣州中醫藥大學實驗動物中心，廣州 510000； 2.空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是全球第二大最常見的男性癌癥，在2018年全球癌癥統計[1]中報告了127萬多新病例和將近36萬死亡病例。高度異質性是其主要特征，目前PCa臨床上的常規治療方案仍然是雄激素剝奪治療法(androgen deprivation therapy，ADT)。然而，大部分原發性PCa患者經過一段時期的ADT治療后，會逐漸對ADT產生耐藥性進而從激素依賴性前列腺癌(hormone na?ve prostate cancer，HNPC)轉化為去勢抵抗性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)[2]。由于CRPC具有侵襲性和高度異質性，致使不同PCa患者對同一治療藥物常表現出不同的反應，導致藥物臨床試驗的成功率大大下降。因此，盡管已經開發出許多PCa細胞系和動物模型，但均未能充分體現PCa的異質轉化特征，導致對其病因和發病機制的了解仍然相當有限，迫切需要異質性模型來概括PCa獨特的臨床表型和基因型。

人源性類器官(patient-derived organoids，PDOs)是指來源于多能干細胞或分離的器官祖細胞在體外通過三維(3D)培養技術分化出具有多種細胞類型，并形成與體內器官相似的器官樣結構[3]。2014年，Gao等[4]成功利用活檢組織標本和循環腫瘤細胞培養出體現PCa特異性改變的類器官模型，推動了類器官參與PCa相關醫學研究的進展。與人源化異種移植(patient-derived xenograft，PDX)、2D細胞系培養等模型相比，PDOs這種體外培養的三維微器官模型不但簡化了動物實驗的繁雜性，還在一定程度上還原了細胞或組織在體內的轉化過程。同時它在培養過程中能較好的維持遺傳穩定性，反映親代腫瘤的特征。類器官可再現腫瘤的異質性并與患者原發瘤對藥物的反應具有較高相關性的特點，可用于模擬并間接觀察處于不同臨床階段且具有不同特異性突變的PCa患者對各種抗腫瘤藥物的反應，并評價其敏感性。同時，PDOs模型便于體外進行大規模高通量藥物篩選，在PCa異質性研究中顯示出獨特的優勢。

1 前列腺癌類器官的培養

1.1 前列腺癌類器官培養條件探索

傳統的PDX模型是將從病人身上得到的新鮮腫瘤組織注射到免疫缺陷小鼠體內進行培養，而PDOs模型則是將分離出的多能干細胞或器官祖細胞置于基質膠中進行三維培養。與2D細胞系培養相比，PDOs的培養方式不僅可以為腫瘤細胞或組織提供類似在腫瘤患者體內生長、發育的環境，還可通過調整培養基配方中的生長因子、激素等篩選不同特異性改變的腫瘤細胞并培育為類器官。Sato等[5]首個開發出類器官通用培養基“ENR”：即Advanced DMEM/F12培養基中加入表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、Noggin及Wnt激動劑R-spondin1。在此基礎上，Karthaus等[6]額外添加了Alk3/4/5抑制劑A83-01、二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)、成纖維細胞生長因子10(fibroblast growth factor-10，FGF10)、FGF2、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、煙酰胺及p38抑制劑SB202190用于人前列腺類器官的培養。其中R-spondin1、Noggin分別通過促進Wnt信號傳導[7]和調節BMP信號通路[8]進而促進類器官細胞增生，且去除R-spondin1或Noggin會導致雄激素受體(androgen receptor, AR)表達的消失[6]。EGF是前列腺類器官增殖和分化所必需的生長因子，FGF2、FGF10和PGE2有助于促進前列腺細胞的增殖[6,9]。A83-01可通過抑制TGF-β信號通路促進細胞持續增殖，與SB202190協同作用有助于延長類器官的培養時間，煙酰胺的加入也有助于提高類器官的培養效率，有趣的是，A83-01、SB202190、煙酰胺均具有相同的抑制細胞分化作用[5-6]，DHT為類器官生長的非必需因子，但其有明顯提高類器官形成效率的作用且能保持前列腺類器官AR信號的完整性[6]。這些生長因子、激素等構成了支持前列腺(癌)細胞在3D培養系統中生存和長期培養的基本條件。由于不同亞型的PCa突變背景不同，所需要的添加物組合也相應有所不同。有研究發現B27、Rho激酶抑制劑Y-27632和N-乙酰半胱氨酸可為人前列腺(癌)類器官的培養提供一定的支持[10]。目前前列腺(癌)類器官的培養條件還在不斷探索和改進中，如Richards等[11]最新發現在前列腺癌上皮細胞中加入原發性前列腺基質細胞共培養不僅可通過維持PCa的特異性分子標記物AMCAR(α-methylacyl- CoA racemase，α-甲基酰基-輔酶A消旋酶)的表達，提高腫瘤類器官的生存率和形成效率，還能引導上皮類器官分支的形成并表達調控分支的因子，如骨形成蛋白、FGF等，促進類器官表達出與原組織相似的表型，提高了類器官對組織特征的概括能力并保持了PCa患者間的異質性。這些研究表明前列腺(癌)類器官是在培養基中添加前列腺特異性生長因子培養出來的，可通過調整培養基修飾進一步優化類器官培養條件，構建不同亞型的PCa類器官。

1.2 前列腺癌類器官模型的建立

前列腺癌類器官來源廣泛，目前已成功利用正常組織、腫瘤活檢樣本、循環腫瘤細胞、PCa細胞系、前列腺癌PDXs模型等分別建立相應的類器官模型。Karthaus等[6]利用小鼠前列腺上皮細胞和人正常前列腺標本培育出由完全分化的CK5+基底細胞和CK8+管腔細胞組成的前列腺類器官，發現該類器官保留了完整的AR信號、前列腺特異性轉錄因子Nkx3.1、基底細胞標記物p63和CK5、管腔細胞標記物CK8的表達，同時將構建的Pten敲除、TMPRSS2-ERG融合基因等小鼠的原組織進行類器官培養后，其表型與原組織的表型一致。同時,Gao等[4]將來自轉移性PCa患者的活檢組織標本、循環腫瘤細胞成功培育出7個概括了PCa亞型的分子多樣性的類器官，充分體現了PCa的臨床異質性，包括TMPRSS2-ERG融合、ETS易位、SPOP突變、SPINK1過表達、FOXA1和PIK3R1突變、CHD1缺失、Pten缺失和AR表達等，較好保留了原發瘤的基因組特征。這表明PCa類器官能很好地重現PCa原發瘤組織的異質性，為PCa研究提供了一種體現腫瘤患者表觀遺傳性和異質性的體外模型。人前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2B細胞及單腔上皮祖細胞也能通過類器官培養技術產生PCa類器官[12-13]，前者為雄激素依賴模型，后者為非依賴模型，分別代表了不同的臨床特征。此外，最近報道了一種結合類器官和PDXs優點的新型體外建模系統，這種PDX-類器官模型比單獨的PDXs模型更節省時間和成本，為類器官的建立提供了充足的組織來源。LuCaP系列是來自PCa轉移灶的外科手術標本，包括了21種前列腺癌的PDX模型。Beshiri等[14]將來自LuCaP系列具有轉移性CRPC(metastatic CRPC，mCRPC)特征的PDX模型組織樣本進行類器官培養，發現其相應的類器官模型保留了mCRPC的基因組異質性和對AR信號的依賴性，成功建立了一個具有代表性的、臨床前PDX衍生類器官平臺，與激素依賴型PCa和非轉移性CRPC形成鮮明的對比，為mCRPC的發病機制、藥物篩選和個性化治療方案的研究提供了一個良好的遺傳學平臺。

2 前列腺癌類器官模型的應用

2.1 前列腺癌發病機制研究

驅動前列腺癌發病和一系列臨床異質性轉化的機制并不是很清楚，其相應的類器官與原發組織相似度較高，并保持基因組表達的穩定性和原代腫瘤組織的異質性，為PCa發病機制及不同階段的臨床特征研究提供了良好模型。有研究已通過動物模型和PDX模型實驗[15-16]證實了新生兒期暴露于雙酚A(bisphenol A，BPA)會增加成年后前列腺癌的易感性。為了檢測人胎兒前列腺是否同樣受到類似的影響，Calderon-Gierszal等[17]將人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESC)定向分化為前列腺類器官，并在整個分化培養過程中暴露于低劑量BPA。期間對該類器官進行前列腺上皮基因和多種前列腺標志物檢測以驗證前列腺的性質，發現其表達CK8/18、AR、p63、TMPRSS2蛋白、PSA、NKX3.1、層粘連蛋白和波形蛋白，證實了hESC可分化為具有與人類前列腺相似的結構和功能特性的前列腺類器官，而BPA顯著提高該類器官波形蛋白、NANOG、CD49f、TROP2的表達和減少其分支的形成，證明低水平的BPA可以靶向hESC，干擾人前列腺形態，特別是前列腺干細胞穩態，這表明發育中的人前列腺可能易受子宮內BPA的干擾，由此提出暴露于低劑量BPA可能會增加人胎兒前列腺在以后生活中癌變的幾率。另外McCray等[18]利用單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術對人原發性前列腺類器官模型進行分析，發現與單層細胞培養相比，類器官培養含有更多不同中間類型的前列腺上皮細胞，并鑒定出10個細胞群，有效展現前列腺癌的異質性，其中包括一種罕見的以角蛋白13(Keratin 13，KRT13)、淋巴細胞抗原6D(Lymphocyte Antigen 6D，LY6D)、LYPD3(Ly6/PLAUR domain containing3)和前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)高表達為特征的前列腺干細胞群。這表明了scRNA-seq分析和PCa類器官培養技術的結合可更深入地了解存在于PCa模型系統中不同的細胞群種類，創建PCa細胞群圖集。此外，PCa類器官體外培養的易操作性也為利用CRISPR/Cas9基因編輯系統等對特定基因進行編輯提供便利性，通過基因編輯可觀察不同基因突變對PCa發生、發展和異質性轉化的影響。

2.2 藥物篩選和個體化治療

由于PCa類器官在保持遺傳穩定性的同時還保持著異質性，已成為腫瘤藥物毒性篩選、藥效評價研究和個體化治療研究的理想模型。Gao等[4]為探索CRPC衍生的類器官是否適合藥物測試，用培育出的PCa類器官對恩雜魯胺、依維莫和BKM-120進行藥物敏感性測試，發現AR擴增的MSK-PCa2細胞系對恩雜魯胺敏感而對其他藥物耐藥，同時存在PTEN缺失和PIK3R1突變的MSK-PCa2對依維莫和BKM-120均敏感，這與體內實驗結果一致，證明其對藥物敏感性的效果與臨床試驗結果相似。另外Beshiri等[14]發現，BRCA2突變的PCa類器官對奧拉帕尼敏感，該結果與在BRCA2突變的CRPC患者臨床治療觀察到的反應一致。這些實驗結果提示運用類器官進行藥物篩選和個體化治療具有一定的可操作性。同時PDXs-類器官平臺結合了PDXs模型優點(展現疾病遺傳和表型多樣性)和類器官(易于體外大規模培養)的特點，可用于擴大體外CRPC模型的數量和多樣性，同時，還為運用高通量篩選技術在體外大規模篩選用于mCRPC的治療藥物和相應的個體化治療方案提供可能。值得注意的是，2018年發表的一項關于類器官模擬轉移性胃腸道癌癥的治療反應的研究中[19]，運用高通量藥物篩選技術測試了類器官對靶向藥物和化療藥物的敏感性，結果表明類器官對抗腫瘤藥物具有高度敏感性和特異性，這表明PDOs模型可以高效預測個別患者的藥物反應，針對不同的病人實現個體化治療。因此將不同PCa患者的新鮮腫瘤樣品制備成PCa類器官培養物并進行個體化建模，通過靶向或高通量的單藥和組合藥物篩選，可進一步指導精準個體化治療和促進新的抗腫瘤藥物的研發。

2.3 耐藥機制

大部分PCa患者會對藥物的治療出現不同程度的耐藥進而發展為CRPC，導致治療難度增加，理想的PDOs模型可以動態展示CRPC的轉化。基因組學和轉錄組學分析顯示，mCRPC可能存在三種耐藥機制[20]：一是基因突變(如AR、ETS、TP53和PTEN基因等突變)導致AR信號通路的激活[21]；二是旁路信號GR(glucocorticoid receptor，糖皮質激素受體)通路的激活促進GR的表達[22]；三是在治療過程中，腫瘤細胞從依賴于藥物靶標轉換為不依賴于藥物靶標，從而獲得耐藥性[23-24]。上述耐藥機制需要在模擬PCa表型和基因型的模型系統中進行驗證，相應的異質性PDOs模型需要展示各自的耐藥機制。目前雄激素敏感的PCa和CRPC類器官模型均已建立，也有通過誘導產生CRPC轉化的模型，同時利用CRISPR/Cas9或慢病毒轉染技術對PCa類器官的特定基因進行基因編輯操作，可使PCa類器官成為快速檢測不同特異性突變對抗腫瘤藥物影響的平臺，為研究PCa耐藥的分子機制提供支持。Pappas等[20]利用前列腺癌類器官模型發現p53基因的缺失不會引起對雄激素分子的抵抗，Pten基因的缺失則增加了對抗雄激素藥物的抗性，而p53和Pten的雙重缺失導致了對第二代抗雄激素的完全抵抗。另外，還發現了前列腺類器官培養基組成會影響藥物反應，如EGF是小鼠和人類前列腺類器官培養基的組成部分，但它可以大大降低對抗雄激素的敏感性，影響PCa耐藥機制的研究。因此，類器官培養有助于在體外通過構建異質性PCa模型，并借助基因編輯技術研究特定基因對PCa耐藥的影響，從而促進一線治療藥物的改進，或是尋找出新的治療靶點提高新藥研發效率。

3 展望

PCa類器官作為一種新型的體外臨床前疾病模型，具有廣闊的應用前景。從疾病模型的角度看，PCa類器官模型不僅便于體外操作，還具有遺傳穩定性和異質性，可結合PDX動物模型對PCa的發病機理、藥物篩選等研究進行多模型驗證[25-27]。從疾病研究角度來看，PCa類器官可以在體外直觀觀察腫瘤細胞或組織的生長、發育變化以及不同突變背景對疾病發生、發展的影響，為研究PCa的異質性轉化機制提供有效的指導，比如，深入了解雄激素抵抗產生的分子機制，發現潛在的治療靶點。從藥物篩選和個體化治療的角度看，利用不同來源的PCa樣本建立不同的原發性或轉移性PCa類器官，并通過結合高通量篩選技術可批量獲得抗PCa藥物和高效預測PCa病人對不同藥物的反應，有助于加速推動開發針對PCa異質性特征的治療方案。從研究耐藥機制的角度看，利用CRISPR/Cas9和shRNA技術對PCa類器官進行表達干擾操作，可以分析耐藥性基因的功能，有針對性改進一線治療藥物或研發新的個體化藥物。

雖然PCa類器官建模已取得較多進展，上皮性和神經內分泌性PCa類器官模型已被建立，但目前為止，神經內分泌細胞的類器官培養方法尚未成熟，還有許多問題需要進一步探討。為了更好的體現PCa的臨床異質性，未來還需要不斷改進培養條件以更好地支持不同類型前列腺癌細胞的生長，進一步研究腫瘤微環境和成纖維細胞、免疫細胞、內皮細胞等的作用，使PCa類器官組織結構更好地代表體內PCa的組成。

同時，PCa類器官依舊存在一些缺點。(1)總體培養成功率較低，限制了臨床多樣性前列腺癌模型的廣泛開發。如Gao等[3]利用轉移性前列腺癌活檢標本培養連續傳代的類器官，總體成功率僅有15%～20%。(2)缺乏從雄激素依賴性到CRPC的模型，mCRPC的模型就更少。目前PCa患者材料來源有限，特別是很難獲得mCRPC患者的臨床樣本，因此建立PCa類器官生物資源庫的困難較多，造成目前可用的CRPC類器官數量很少，不能完全代表臨床疾病的異質性，這使得類器官在PCa研究中的應用受到限制。(3)PCa類器官建模還受到一些培養條件的限制，如培養出的PCa類器官只含有上皮細胞和(或)基質細胞，還缺乏某些腫瘤組分，如免疫細胞、血管成分等等。目前具有免疫兼容性微環境的PCa類器官模型尚未開發，無法進行免疫治療方面的研究。另外PCa類器官的某些培養基成分會影響藥理反應，如EGF可能會影響PCa類器官對藥物的敏感性。總之，還需要對PCa類器官的培養條件不斷優化，構建更加適應PCa不同突變背景的腫瘤微環境，進一步提高PCa類器官培養的成功率，以期獲得更多不同表型和基因型的PCa類器官，特別是構建從HNPC到CRPC直至mCRPC發生的模型，充分展示PCa臨床異質性，構建相應的類器官庫。

綜上所述，類器官在PCa異質性研究方面雖然已取得一定的進展，但仍存在許多挑戰，還需要不斷進行探索。相信隨著相關技術的發展，PCa類器官的建模體系會不斷完善，逐步形成PCa生物資源庫，最大限度展示其臨床特征，成為PCa首選的臨床前疾病模型。