增強海藻糖胞內積累提高大腸桿菌耐受性與乙醇產率

王驚春，田康明，苗佳，王彩喆，金鵬，王正祥*

1(天津科技大學 化工與材料學院，天津,300457) 2(天津科技大學 生物工程學院，天津,300457)

隨著全球化石燃料儲備的全面枯竭和人們對環境問題的日益重視，生物質乙醇成為了最具潛力的化石燃料的替代品[1]。大腸桿菌因其具有清晰的研究背景、簡單的遺傳操作和先進的工業經驗，已成為最可能用于生物質乙醇生產的新一代菌種之一。通過引入來源于Zymomonasmobilis的乙醇合成途徑，重組大腸桿菌獲得了較高的乙醇產率，乙醇占發酵產物的95%以上[2-3]。但與酵母生產菌種相比，重組大腸桿菌對高濃度底物(糖)和產物(乙醇)的耐受性較低。

乙醇發酵過程中菌株受到的主要環境脅迫包括：(1)發酵初期，生物質水解液中高濃度單糖(主要是葡萄糖)的滲透壓力對大腸桿菌細胞生長和酶生物合成的不利影響[4-5]。(2)隨著發酵的進行，乙醇含量積累，高濃度乙醇開始影響細胞形態和生理活性，成為影響乙醇產量的主要因素。在此環境下，大腸桿菌自身具有應對這些環境壓力的耐受機制[6]，例如細胞膜組成成分的改變[7-10]、依賴于熱激蛋白的壓力應激系統[11-12]和積累各種壓力保護劑等。

海藻糖是大腸桿菌遭受環境脅迫時，合成并積累的一種最重要的相容性溶質。海藻糖最重要的功能是保護細胞膜結構中的蛋白質和脂質免受不同類型的壓力損傷，如高溫和凍融等[13]。大腸桿菌中，海藻糖的生物合成由操縱子otsBA負責，otsA編碼海藻糖-6-磷酸合成酶，otsB編碼海藻糖-6-磷酸磷酸化酶[14]。滲透壓力、高溫、低溫、干燥和生長進入穩定期時，通過rpoS編碼的轉錄起始因子誘導其表達[15-16]，激活海藻糖的合成。大腸桿菌在不同的滲透壓力條件下，海藻糖通過不同的途徑分解，分別由3種酶催化：周質海藻糖酶(TreA)、胞質海藻糖酶(TreF)和海藻糖-6-磷酸水解酶(TreC)。在高滲透壓和細胞生長轉入穩定期時，TreA表達增加[17-18]。treF的轉錄僅受高滲透壓的微弱誘導，部分依賴于穩定期的轉錄起始因子RpoS[19]。TreC的表達僅在低滲透壓力條件下受海藻糖誘導[20]。

通過基因工程手段改變海藻糖代謝途徑，發現大腸桿菌的海藻糖含量與壓力耐受性之間存在相關關系[21]，而海藻糖積累對產乙醇大腸桿菌工程菌株的壓力耐受性和發酵性能的影響，則至今沒有解釋。為此，本文對具有工業前景的大腸桿菌B0013-1031H中海藻糖代謝途徑進行改造，評價重組菌的葡萄糖與乙醇耐受性和乙醇合成效率的改變，以期獲得在更高底物濃度下高效合成乙醇的新菌株，為產乙醇大腸桿菌優良菌種的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本文所用的菌株和質粒見表1。出發菌株E.coliB0013-1031H為本實驗室前期構建，其中pta-ackA，ldhA，pflB和frdA基因已被刪除，以阻斷副產物乙酸、乳酸、甲酸和琥珀酸的形成[22]。pMD19T-simple載體購自寶生物工程(大連)有限公司。攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關鍵酶基因pdc和adhB的質粒pEtac-PA，為本實驗室前期構建[3]。

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 培養基

LB培養基(5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl)作為菌株活化和培養的常規培養基。固體培養基添加15 g/L瓊脂。必要時添加100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)、30 μg/mL慶大霉素(Gm)或50 μg/mL卡那霉素(Km)。改良M9基礎培養基[24]添加5 g/L葡萄糖，作為種子培養基，以及搖瓶發酵試驗中細胞生長培養基，細胞生長結束，補加需要的葡萄糖，用于乙醇發酵。LB培養基和M9基礎培養基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。500 g/L葡萄糖貯備液在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.3 基因操作

常見的分子操作按照標準方法進行。根據本實驗室前期建立的方法[23]，應用Red同源重組技術，對海藻糖分解代謝相關基因treA、treF和treC進行敲除，對海藻糖生物合成操縱子otsBA的啟動子進行替換，本文所用引物見表2。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this study

續表2

引物序列(5′-3′)treCF1ATGCGGAAAGCGAACAGTAtreCR2ATCACGCCGAGGTTGTTACtreCInv1TCATCACCAAAGCGAGAAAtreCInv2AGACCGCAGAAGAGTGGAACaraHF1TTGCTGCTGAATAAAACCACCTTTGGaraHR2 CTCGGGCCCGGTTCTCCTCCTTCTCTTTTCTTATTGPldhAF1GAGGAGAACCGGGCCCGAGCGTCATCAGCAGPldhAR2GTTAACGGTTCTGTCATAAGACTTTCTCCAGTGATGTTGAATCACotsBF1TGGAGAAAGTCTTATGACAGAACCGTTAACCGAAACCCCotsBR2CTCCAGACATCCGGCACACCRldhAF1GAGCGTCATCAGCAGCGTCRaraHR2 GGTTCTCCTCCTTCTCTTTTCTTATTG

1.4 海藻糖代謝途徑阻斷和合成途徑強化突變株的構建

以B0013-1031H染色體DNA為模板，以引物treAF1和treAR2，擴增treA基因，克隆入經SmaⅠ酶切的載體pSKsym后獲得重組質粒pSKsym-treA。重組質粒用引物treAInv1和treAInv2反向PCR擴增含有treA基因上下游同源臂和pSKsym載體骨架的片段。提取質粒pSK-EcdifGm，經SmaⅠ酶切后，回收dif-Gm-dif片段，與上述反向PCR擴增的產物連接，獲得含有treA基因敲除突變盒的重組質粒pSKsym-treA’::difGm。以該質粒為模板，用引物treAF1和treAR2擴增獲得突變盒片段treA’::difGm，DpnⅠ消化模板后純化備用。將突變盒treA’::difGm電轉化入菌株B0013-1031H/pKD46，經Red重組和Xer重組后獲得突變株B0013-1031H(ΔtreA::dif)。使用相同的方法在該菌株中進一步敲除treF和treC基因，獲得的突變株B0013-1031H(ΔtreA::dif，ΔtreF::dif，ΔtreC::dif)記為JC31。

以大腸桿菌B0013-1031H染色體DNA為模板，分別用引物araHF1/araHR2、PldhAF1/PldhAR2和otsBF1/otsBR2擴增araH(589 bp)、PldhA(287 bp)和otsB(710 bp)基因片段，再通過重疊PCR擴增出araH-PldhA-otsB基因片段。將araH-PldhA-otsB基因片段克隆入載體pMD19T-simple后獲得重組質粒T-araH-PldhA-otsB。該重組質粒用引物RldhAF1和RaraHR2反向PCR擴增后，在啟動子PldhA上游克隆入dif-Gm-dif片段，獲得含有突變盒的重組質粒T-araH’-PldhA-otsB’::difGm。以該重組質粒為模板，再用引物araHF1和otsBR2擴增獲得突變盒片段araH’-PldhA-otsB’::difGm，DpnⅠ消化模板后純化備用。采用電轉化方法，將突變盒araH’-PldhA-otsB’::difGm轉入菌株JC31/pKD46，經重組后獲得的突變株，記為JC41。

1.5 葡萄糖和乙醇耐受性試驗

耐受性試驗按照文獻[25]中方法并加以調整。測試菌株分別劃線于LB瓊脂平板上，37 ℃培養過夜。挑取單菌落接種于50 mL LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養12 h。調整菌液初始濃度相同，再用M9培養基稀釋不同倍數，每次稀釋4倍，分別稀釋1、2、3、4和5次。稀釋后的菌液分別取5 μL滴于含有不同葡萄糖和乙醇濃度壓力的M9平板上，37 ℃培養3 d。

1.6 產乙醇重組菌的構建

將攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關鍵酶基因pdc和adhB的質粒pEtac-PA分別轉化出發菌株B0013-1031H、海藻糖代謝途徑改造突變株JC31和JC41，分別命名為B0013-1031H-PA、JC31-PA和JC41-PA。

1.7 乙醇發酵試驗

取保藏于-70 ℃的保藏物劃線于LB平板(含50 μg/mL Km)，37 ℃條件培養過夜，單菌落接種LB液體培養基，37 ℃，200 r/min培養12 h，細胞生長至OD600值為3左右。離心(8 000 r/min，5 min)收集菌體，用M9培養基洗滌并重懸，作為種子液接種于50 mL含5 g/L葡萄糖的M9液體培養基中，接種量控制在初始OD600值為0.1。開始2階段發酵：好氧為菌體生長階段，培養條件為37 ℃，200 r/min振蕩培養12 h；隨后轉入發酵階段，每瓶補加所需的葡萄糖、終濃度1%的蛋白胨和2 g滅菌的CaCO3，用橡皮塞密封瓶口，置于37 ℃培養箱中靜置發酵。

1.8 分析與測定

發酵過程中定時取樣，檢測菌體量、胞內海藻糖含量、葡萄糖濃度和乙醇濃度。

1.8.1 菌體量測定

菌體量采用濁光度法，600 nm波長下測定。細胞干重采用65 ℃烘干至恒重測定。發酵階段樣本先經等體積1 mol/L的HCl去除CaCO3后再通過濁光度法或烘干恒重法測定菌體量。

1.8.2 海藻糖含量測定

取30 mL待測菌液于50 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min。棄上清，用1 mL PBS緩沖液洗滌細胞，8 000 r/min離心5 min。棄上清，加2 mL去離子水重懸細胞，吸取1 mL細胞懸液分別于1號和2號EP管中。1號EP管8 000 r/min離心5 min后棄上清，細胞沉淀烘至恒重后測細胞干重。2號EP管于-70 ℃冷凍過夜后，100 ℃煮沸20 min，12 000 r/min離心15 min，上清液即為細胞溶解產物，用于胞內海藻糖含量的測定。

使用酶法測定胞內海藻糖含量(該測定方法通過使用課題組克隆表達的新型海藻糖酶徹底水解海藻糖形成葡萄糖進而通過葡萄糖含量測定標定海藻糖含量。方法建立過程及其在海藻糖測定中的應用近期另文發表)。吸取0.5 mL細胞溶解產物，加0.5 mL海藻糖酶液，以0.5 mL細胞溶解產物加0.5 mL緩沖液作為對照。于55 ℃下反應30 min，使用生物傳感儀檢測葡萄糖生成量，計算海藻糖濃度。

1.8.3 葡萄糖和乙醇含量測定

采用SBA-40C生物傳感儀酶膜法測定葡萄糖和乙醇濃度。所有數據均為3次平行試驗結果的平均值。

2 結果與分析

2.1 海藻糖代謝途徑阻斷和合成途徑強化

按照方法1.4，通過同源重組敲除海藻糖分解代謝相關基因treA、treF和treC，獲得了突變株JC31；通過同源重組將ldhA基因的啟動子整合于JC31菌株的otsB基因上游，獲得了突變株JC41。分別用引物treAF1/treAR2、treFF1/treFR2、treCF1/treCR2和araHF1/otsBR2對出發菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41進行PCR鑒定。B0013-1031H分別擴增出treA(2.4 kb)、treF(1.7 kb)、treC(2.8 kb)和araH-otsB(1.3 kb)(圖1-A)；突變株JC31分別擴增出treA’::dif(1.0 kb)、treF’::dif(1.0 kb)、treC’::dif(1.0 kb)和araH-otsB(1.3 kb)(圖1-B)；突變株JC41分別擴增出treA’::dif(1.0 kb)、treF’::dif(1.0 kb)、treC’::dif(1.0 kb)和araH’-PldhA-otsB’::dif(1.6 kb)(圖1-C)。PCR鑒定結果說明突變株JC31和JC41構建成功。

M-1 kb DNA Ladder Marker; 1～4分別為: treA、treF、treC和araH-otsB; 5～8分別為: treA’::dif、treF’::dif、treC’::dif和araH-otsB; 9～12分別為: treA’::dif、treF’::dif、treC’::dif和araH’-PldhA-otsB’::dif圖1 E. coli B0013-1031H及其突變株JC31和JC41的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of E. coli B0013-1031H(A)and its mutants JC31(B) and JC41(C)

2.2 大腸桿菌海藻糖代謝途徑突變株的海藻糖積累

在獲得了海藻糖代謝途徑突變株后，進一步研究了其胞內海藻糖合成與積累水平。根據所述方法分別測定對照菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41在不同培養條件下的海藻糖積累，結果如圖2所示。

圖2 E. coli B0013-1031H及其突變株JC31和JC41在不同培養條件下的胞內海藻糖含量Fig.2 Intracellular trehalose content of E. coli B0013-1031Hand its mutants JC31 and JC41 under different conditions

與菌株構建的預期一致，在不同條件下，突變株JC31和JC41均比對照菌株B0013-1031H具有更高的胞內海藻糖含量。在普通培養條件下(含0.5%葡萄糖的M9培養基)，突變株JC31的胞內海藻糖含量為8.28 mg/g細胞干重，約為出發菌株的3倍；突變株JC41的胞內海藻糖含量為28.03 mg/g細胞干重，約為出發菌株的12倍(出發菌株B0013-1031H的胞內海藻糖含量為2.35 mg/g細胞干重)。說明阻斷菌株海藻糖分解途徑和加強海藻糖合成途徑顯著提高了菌株的海藻糖積累水平。

2.3 海藻糖積累提高了大腸桿菌底物和產物耐受性

為了評價海藻糖積累對大腸桿菌耐受性的影響，對出發菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41在較高濃度葡萄糖和乙醇脅迫環境下的耐受性進行分析，結果見圖3。在沒有葡萄糖壓力的M9(含0.5%葡萄糖)平板上，出發菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41 3株菌的生長情況基本一致。而在含6%和8%葡萄糖的M9平板上，3株菌的生長均受到較大程度的滲透壓力的抑制。但在相同的稀釋倍數下，突變株JC31和JC41的菌落數明顯多于菌株B0013-1031H。在沒有乙醇脅迫的M9(含0.5%葡萄糖)平板上，出發菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41 3株菌的生長情況基本一致。而在僅含1%和2%乙醇的M9平板上，3株菌的生長均受到較大程度的抑制，可見乙醇對細胞活性的傷害很大。但在相同的稀釋倍數下，突變株JC31和JC41的菌落數明顯多于出發菌株B0013-1031H。說明海藻糖代謝途徑突變株JC31和JC41與出發菌株B0013-1031H相比，對高濃度葡萄糖和乙醇壓力有更高的耐受性，明顯具有更好的生長能力。

圖3 E. coli B0013-1031H及其突變株JC31和JC41的耐受性Fig.3 Stress tolerance of E. coli B0013-1031H andits mutants JC31 and JC41

與菌株的胞內海藻糖含量(圖2)對照來看，在無壓力條件下，菌株的胞內海藻糖積累對細胞生長沒有影響，3株菌的生長狀況相似；在葡萄糖壓力下，突變株JC31的生長狀況最好，其胞內海藻糖含量也最高；在乙醇壓力下，突變株JC31和JC41的生長狀況相近，胞內海藻糖積累水平也相近。可見菌株對壓力環境的耐受性高低與其胞內海藻糖積累水平一致，海藻糖積累越高，菌株的耐受性越強。

2.4 乙醇發酵性能評價

將攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關鍵酶基因pdc和adhB的質粒pEtac-PA分別轉化出發菌株B0013-1031H、突變株JC31和JC41，獲得了產乙醇重組大腸桿菌B0013-1031H-PA、JC31-PA和JC41-PA。根據1.7所述方法分別在50和120 g/L葡萄糖濃度下進行乙醇發酵試驗，定時取樣分析菌體量、葡萄糖、乙醇和胞內海藻糖含量。

在50 g/L葡萄糖的發酵條件下，菌株JC41-PA的菌體量與B0013-1031H-PA和JC31-PA逐漸顯示出差異，JC41-PA的最大菌體量為4.13 g/L，較對照提高了6.4%(圖4-a)，胞內海藻糖的大量積累提高了菌株在50 g/L葡萄糖的發酵條件下的菌體生長能力。3個菌株的乙醇轉化率和產量基本相同，但是海藻糖積累菌株JC31-PA和JC41-PA的葡萄糖消耗速率和乙醇合成速率均略低于對照菌株(圖4-b)，這與其胞內海藻糖含量表現出明顯的相關性，胞內海藻糖含量越高的菌株，其乙醇發酵效率越低。在厭氧發酵初期，3個菌株受到葡萄糖滲透壓力的誘導，胞內海藻糖積累水平均有大幅度的升高(圖4-c)。

a-菌體量； b-乙醇產量；c-海藻糖積累●-B0013-1031H-PA; ▲-JC31-PA; ■-JC41-PA圖4 50 g/L葡萄糖條件下產乙醇重組E. coli的代謝特征Fig.4 The metabolic properties of ethanologenic E. coli in 50 g/L glucose

在高于120 g/L的葡萄糖質量濃度的發酵條件下，菌株B0013-1031H-PA、JC31-PA和JC41-PA的菌體量始終保持基本相同(圖5-a)，菌株胞內海藻糖積累對其在120 g/L葡萄糖的發酵條件下的菌體生長無顯著影響。3個菌株的發酵效率隨時間的延長都逐漸降低，伴隨乙醇的大量積累，菌株JC31-PA逐漸表現出最優良的發酵性能。菌株JC31-PA的最大乙醇產量為50.6 g/L，較對照菌株提高了5.42%(對照菌株為48 g/L)；乙醇轉化率為48.72 g/100 g葡萄糖，較對照菌株提高了12.67%(對照菌株為43.24 g/100 g葡萄糖)，達到理論轉化率的95%(圖5-b)。一定程度上提高胞內海藻糖含量，從而提高了菌株在120 g/L高糖濃度下的乙醇發酵性能；而胞內海藻糖更高水平地積累，則可能會阻礙葡萄糖的運輸和利用，從而降低了乙醇發酵效率。3個菌株的胞內海藻糖含量不僅在厭氧發酵初期發生大幅增長，在發酵36 h后又發生一次不同程度的增長(圖5-c)，這可能與高濃度底物的發酵條件下，發酵后期較高的乙醇濃度誘導有關。

a-菌體量; b-乙醇產量;c-海藻糖積累●B0013-1031H-PA; ▲JC31-PA; ■JC41-PA圖5 120 g/L葡萄糖條件下產乙醇重組E. coli的代謝特征Fig.5 The metabolic properties of ethanologenic E. coli in 120 g/L glucose

3 討論

海藻糖是細胞中一種重要的壓力保護劑，海藻糖過量積累可以有效提高大腸桿菌在高溫、高滲透壓力和一些高濃度發酵產物中的生長能力[21]。

本研究利用Red同源重組技術敲除大腸桿菌B0013-1031H中海藻糖分解途徑獲得突變株JC31，并進一步加強其海藻糖合成途徑獲得突變株JC41，顯著提高了菌株胞內海藻糖的合成與積累，并顯著提高了其對葡萄糖和乙醇的耐受性。

進一步引入乙醇合成途徑后，獲得了產乙醇重組大腸桿菌B0013-1031H-PA、JC31-PA和JC41-PA。在更高濃度底物(葡萄糖)的發酵條件下，海藻糖積累菌株JC31-PA的發酵性能較對照菌株得到改善，乙醇產量和轉化率顯著提高。

發酵液中乙醇濃度增加1%，僅蒸餾階段就可以節約蒸汽150 kg[26]，更高的乙醇產率對降低能耗和廢液排放、節約生產成本和提高經濟效益具有重要意義，因此提高菌株對更高濃度底物和乙醇的耐受性，并提高其在更高濃度底物下的發酵性能成為了對乙醇生產菌種的重要要求。本研究結果表明，通過海藻糖代謝途徑改造，一定程度上提高大腸桿菌胞內海藻糖積累，是提高產乙醇重組大腸桿菌在高濃度底物發酵下的乙醇產率的有效策略和技術途徑。但是胞內海藻糖含量最高的菌株其發酵效率卻有所下降，因此還有待于進一步精確調控海藻糖積累水平，以實現產乙醇重組大腸桿菌耐受性和乙醇產率的最優化，為實現工業化生產奠定基礎。